促血管新生药物研究--2009.10

促血管新生及其药物研究李悦山教授DepartmentofPharmacologyTel:81340203一.血管系统的形成：⑴血管生成(vasculogenesis)⑵血管新生(angiogenesis)血管新生(angiogenesis)在原来存在的血管结构基础上通过血管内皮细胞（VEC)的增殖和迁移长出新血管的过程。血管生成(vasculogenesis)主要发生在胚胎期，血管由成血管细胞生长形成，是血管从无到有的过程。（胚胎）（胎儿）（胚胎）（一）血管新生过程:分期初期:各种刺激因素促使血管新生因子分泌增加。如血管损伤、创伤、局部炎症反应、肿瘤生长等。增生侵入期：细胞外基质降解，内皮细胞迁移、增生和侵润。成熟分化期：管腔形成，内皮分化，血管结构修整、改建，形成成熟血管。药理学血管新生过程:1.基底膜破坏胶原酶(collagenases)基质金属蛋白酶(MMP)尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)整合素v32.内皮迁移3.内皮细胞增生4.管腔形成5.基底膜再形成周细胞游走，形成完整的微血管结构。血管新生的方式:1.芽生式原有毛细血管基础上发芽生长。2.非芽生式原有血管被分割成多条血管。（二）血管新生的调控药理学血管新生调控平衡学说：正常情况下血管新生诱导因子与抑制因子处于动态平衡。促血管新生的细胞因子VEGF、bFGF、PDGF、促血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1），血管生成素（angiogenin），胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-1），转化生长因子β（TGF-β），TNFα、IL-8等。血管新生的抑制因子血管新生抑制素（angiostatin)内皮细胞抑制素（endostatin)促血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPS）血小板反应蛋白-1（TSP-1）迁移抑制因子（MIG），PF-4等。促血管新生应用的细胞因子血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）促血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）新发现的促血管生成素（Ang）及其受体。CancerResearch2000，60：203-又称血管通透因子(VPF),对热和酸都相当稳定的二聚体糖蛋白。特异性作用于VEC，促进VEC增殖、游走，上调血管新生。二.血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）药理学1.VEGF的分类：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-EVEGF-A发现早，研究较多，根据其mRNA的剪切方式可形成七种蛋白异构体：VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF206。正常人及动物心肌、SMC、VEC等低表达，肿瘤细胞表达增加。其中VEGF121和VEGF165在人体内分布最丰富。2.VEGF的来源：VEGF表达的有效刺激：缺血/缺氧，通过缺氧诱导因子-1（HIF-1）增加VEGF基因转录。VEGFR-1：（Flt-1）fms样的酪氨酸激酶-1,180kDVEGFR-2：（Flk-1/KDR,）胎-肝激酶-1（Flk-1）/含激酶插入区（KDR），200kDVEGFR-3（Flt-4，180kD）——淋巴内皮表达fms样的酪氨酸激酶-4（Flt-4），180kD3.VEGF受体：表达于血管内皮细胞VEGF＋受体受体自身磷酸化信号转导硫酸乙酰肝素神经纤毛蛋白•胞外段：7个免疫球蛋白样的VEGF结合区，500-850个氨基酸残基。•跨膜段：高度疏水，约有22-26个氨基酸残基。•胞内段：酪氨酸激酶区，有ATP识别位点和结合位点有受体自身磷酸化位点。VEGF受体结构VEGF分类与受体结合CancerResearch2000，60：203-VEGF与受体结合后的信号转导机制1.经Ras蛋白激活ERK（细胞外信号调节激酶），启动Ras-Raf-ERK信号通路2.经PLC-γ信号转导-激活PKC，启动Raf-MAPKK-MAPKS信号通路。3.磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K），促进细胞由G1期进入S期，参与血管内皮细胞生长的调节。4.激活FAK：VEGF可通过非受体型TPK中的FAK家族的激活，促进血管内皮细胞的迁移。PharmacolRev2004;56:549–580Akt:PI-3K激活的蛋白激酶bCirculationResearch.2003;93:87-4.VEGF分子特性：VEGF121为可溶性，分泌后易弥散。VEGF189和VEGF206分泌后与细胞表面、基底膜及细胞外基质含有肝素的蛋白多糖结合促增殖。VEGF165具有两种特性：⑴可溶性，便于肌肉注射和静脉注射。⑵可与蛋白多糖结合，延长其作用时间。治疗性血管新生（therapeuticangiogenesis)三.VEGF的应用研究药理学——将外源性生长因子转入组织，增强缺血区域侧枝血管新生。1.VEGF蛋白治疗：局部使用，改善血液供应。心肌缺血，心肌梗塞边缘带的挽救，减少心肌梗塞面积，改善心功能，预防PTCA后再狭窄及心血管保护，外周血管闭塞性病变等。（分子搭桥）CardiovascularResearch.2001.49:568-uPA:尿激酶型纤溶酶原激活剂tPA:组织型纤溶酶原激活剂VEGF蛋白治疗存在问题：VEGF的生物半衰期短(t1/2＜6min),因此疗效短暂，需反复给药。给药剂量、给药次数差异大。大量全身应用，NO介导血压下降，心率加快。药理学AmJPhysiolCellPhysiol.2001.280:C1375-1998年波士顿Tufts心脏中心首次用质粒phVEGF165治疗5例冠心病患者，经美国NIH和FDA批准，开始phVEGF165治疗的Ⅰ期临床药理试验。现已准许进入临床应用。进一步临床药理试验。（Circulation.1998,98:2800-2808）2.基因治疗——基因转移技术人类VEGF基因全长14kb，有8个外显子和7个内含子组成。第1外显子表达分泌肽序列，能使VEGF从细胞内完整分泌出来，通过旁分泌作用于邻近VEC。第7外显子表达多肽促内皮增殖活性最强。因此VEGF165成为治疗性血管新生的主要候选基因。VEGF基因组成VEGF基因组成5’UT3’UTJBIOCHEM1997,272:7151–基因转移的方法：质粒DNA：将VEGF165的DNA导入体内靶细胞，使其得以表达，取得治疗效果。如质粒DNA为载体—phVEGF165病毒性基因转移：用带有目的DNA的复制缺陷性病毒感染靶细胞，使目的基因持续表达，取得治疗效果，如缺陷性腺病毒载体的VEGF165cDNA（AdCMVVEGF165cDNA）转录病毒载体(RV)单纯疱疹病毒载体等转基因动物实验Science,1999，286：2511-1.基因治疗的安全性：是否忠实长效表达？2.转染率：质粒DNA转染率低，腺病毒转染率高，但可产生病毒蛋白，有抗原性。3.血管新生对糖尿病视网膜病变的影响。存在问题：药理学四.干细胞治疗（stemcell）Circulation.2003;107:929Deliveryoptionsforstemcelltransfermodalitiestotheheart.干细胞对心肌缺血的治疗机制五.促血管新生中药研究方法：体外研究：细胞培养，血管段培养在体研究：CAM，大鼠肠系膜、仓鼠颊膜，大鼠下肢模型，兔角膜。——中药筛选及其作用机制研究药理学1.鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型（chickchorioallantanoicmembrane,CAM）方法：1.孵化种蛋6-7d，无菌操作开窗（1×1cm），造假气室，观察CAM。2.加入含药载体（0.45μ纤维素微孔滤膜），2次/d，连续3d无菌加药，含药血清、药物或生理盐水作用4d，取样。3.固定（甲醛/丙酮），去鸡胚，取CAM。对照组CAM中药组CAM对照组C中药组药理学当归、黄芪（黄芪甲甙）、三七，山茱萸、熟地、枸杞子、龟板胶等。方剂：如活血（当归补血汤）、补血、益气方药等。2.中药血清药理学的筛选：进一步进行化学组学研究中药化学组学研究含药血清、中药、方剂及提取物等HPTLCHPLC-MS（液-质联用仪）中药成分的化学组学指认GC-MS（气-质联用仪）2.细胞培养方法：二维培养，三维培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养微血管内皮细胞（HMEC）培养细胞株：EA.hy926，ECV304谢谢心血管新药研究与开发概况李悦山DepartmentofPharmacology1994-1998年心血管创新药物研究情况