啤酒酵母ECM25YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影

生物工程学报ChinJBiotech2008,August25;24(8):1420-14[e-mail]©2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:December18,2007;Accepted:March4,2008Supportedby:theNationalKeyTechnologyR&DProgramofChina(No.2007BAK36B01).Correspondingauthor:QiLi.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]国家“十一五”重大科技支撑专项(No.2007BAK36B01)资助。研究报告啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响张一心,李崎,沈微,谢焱,顾国贤江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122摘要:以pUG6为模板,设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物,构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒,转化啤酒酵母G-03,获得一株G-03/a转化菌,遗传稳定性良好,测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后,与原菌株相比,转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%,发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%,成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6d后,与原菌株相比,转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母,能够提高啤酒的风味稳定性。关键词:啤酒酵母,基因敲除,ECM25,谷胱甘肽,分泌,啤酒风味稳定性EffectsofKnockoutECM25/YJL201WGeneinBrewingYeastonBeerFlavorStabilityYixinZhang,QiLi,WeiShen,YanXie,andGuoxianGuTheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,ChinaAbstract:TheECM25deletionmutantofindustrialbrewingyeast,G03/a,wasconstructedbyreplacingtheECM25genewiththekanMXgene.Thetransformantwasverifiedtobegeneticallystable.ThePCRanalysisshowedthatECM25geneintheG-03/awasdeleted.Underaerobicconditionsof11oCand28oC,comparedwiththehoststrainG-03,theexcretiveglutathioneconcentrationofG-03/aincreasedby21.4%and14.7%,respectively.StrainsG-03andG-03/awereinoculatedinflasksandcultivatedcontinuouslyfor4generations.ComparedwiththehoststrainG-03,theglutathioneconcentrationinthemainfermentationbrothandfinalbeerofstrainG-03/aincreasedby32.1%and13.8%,thestabilityindex(SI)increasedby7.7%and5.3%,respectively,andtheflavorresistancestalingvalue(RSVvalue)infinalbeerincreasedby45.0%.DuringEBCfermentation,theglutathioneconcentrationinthemainfermentationbrothofstrainG-03/aincreasedby34.0%,comparedwiththehoststrainG-03.Furthermore,nosignificantdifferenceinroutinefermentationparameterswasfound.ThestrainG-03/aisprovedtobeanexcellentanti-stalingbrewingyeasttoimprovebeerflavorstability.Keywords:brewingyeast,geneknockout,ECM25,glutathione,excretion,beerflavorstability张一心等:啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对碑酒风味稳定性的影响1421Journals.im.ac.cn风味稳定性作为啤酒的重要质量指标之一,从20世纪70年代开始就受到国外学者的关注[1,2]。啤酒酵母是啤酒生产的灵魂,是对啤酒风味和风味稳定性具有决定作用的因素之一。啤酒是非常复杂的体系,其中有些化合物会通过一系列反应,使啤酒风味不断变化,最终导致风味老化。但是啤酒酵母会产生一些具有抗老化功能的还原性物质,如还原型谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐和还原酮等,它们都能协助消除氧自由基的积累。此外,GSH也能防止酿造酒色泽改变和香气损失并有抑菌的作用[3]。ECM25基因位于酵母X号染色体,可能和细胞壁生物合成、结构及蛋白质运输相关[46]。Perrone等已经发现,酵母ECM25基因的缺失,或液泡蛋白质分选等基因的缺失,会影响GSH的运输途径,从而改变GSH的内稳态并导致其过量分泌[79],但是这些菌株通常只是用于实验室研究的营养缺陷型,而工业啤酒酵母是野生型菌株,且没有关于工业啤酒酵母ECM25基因缺失和胞外分泌GSH的报道。啤酒生产时酵母合成和分泌的GSH可以显著延长啤酒的风味保鲜期[1012]。本次研究主要是对一株工业啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)G-03通过同源重组,以卡那抗性基因替换,敲除ECM25基因,获得了一株GSH分泌量增加的抗老化啤酒酵母菌株G-03/a。摇瓶发酵结果表明,转化菌酿制啤酒的风味基本保持不变,GSH分泌量增加,成品啤酒的风味稳定性提高。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种和质粒啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)MI4,是前期研究以青岛啤酒酵母青②为出发菌株通过蛋氨酸连续驯养得到的GSH合成能力提高的啤酒酵母[10],啤酒酵母(S.carlsbergensis)G-03,大肠杆菌JM109和DH5为本实验室保存。质粒pMD-18T购自TaKaRa公司。pUG6为本实验室保存。1.1.2主要试剂2-苯叔丁基硝酮(PBN纯度为98%),聚乙二醇3350(PEG3350),单链载体DNA(来自沙门氏试验中Ⅲ型脱氧核酸钠盐)均购自Sigma公司。二苯代苦味酰肼自由基(DPPH纯度为90%)购自东京工业株式会社,PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和DNAmarker购自上海生工生物工程技术服务有限公司,TaqDNA聚合酶、dNTP购自上海博彩生物科技有限公司。引物由上海生工合成(表1)。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3培养基麦汁培养基:实验室全麦芽自制(11ºP),酒花添加量为0.4g/L。YPD培养基:酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L;若为筛选培养基,加入G418,使其在培养基中的终浓度为200mg/L。1.2方法1.2.1破坏盒的构建以pUG6为模板,Pecout01、Pecout02为引物,PCR循环参数为:94oC,5min;30个循环:94oC,40s,56oC,90s,72oC,2min;72oC,12min;4oC保温。取3LPCR产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳。将得到的破坏盒,40管合并为1管(2000L),用酚及酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,再用70%乙醇洗涤2次,空气中干燥后,将沉淀溶于50μL的1×TEbuffer。表1PCR介导基因破坏引物和验证引物Table1OligonucleotidesusedinPCR-mediatedgenedisruptionandverificationPrimersSequence(5′→3′)ForgeneknockoutPecout01TCGACTTATTTGCCAGCATCTGATGAAATTGGCGATAGGTCGACAACCCTTAATATAAC1422ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2008Vol.24No.8Journals.im.ac.cnPecout02TAGCCTGCTAACCTTGTTGCTTGCTTTAATATCTGGTGGATCTGATATCACCTAATAACForPCRverificationPkanT02TTCCATAGGATGGCAAGATCPecmT02TCTTTGTGGACTAGGGCTTCPecm01ATGATAGATATCAACGTTAATAACPecm02TTACCACCTTTGTTTCATTTCATTC1.2.2啤酒酵母感受态的制备、转化及筛选啤酒酵母感受态的制备和转化见文献[13]。在含G418终浓度为200mg/L的YPD平板上涂布筛选转化子,培养5~7d后,将长出的酵母在G418平板上再划线一次,得到单菌落。1.2.3基因组DNA提取及转化菌的鉴定基因组DNA的提取见文献[13],使用表1的引物进行PCR验证,PCR循环参数为:94oC,5min;30个循环:94oC,40s,50oC,90s,72oC,2min;72oC,12min;4oC保温。取3LPCR产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳。1.2.4转化菌的遗传稳定性将转化菌在YPD斜面上连续移接10代,将10代转化菌在含200mg/LG418的YPD平板上划线。将第3代、5代、7代、10代转化菌接种于YPD液体培养基,180r/min培养1d,收集细胞,提取基因组DNA,以酵母基因组DNA为模板,PCR验证。1.2.5低温发酵(1)锥形瓶发酵:斜面菌种经扩培,接种于含有300mL麦汁的锥形瓶中,于11oC低温培养箱中进行主发酵,发酵6d后,主发酵结束,取部分发酵液过滤测定各项理化指标及老化指标,其余装瓶4oC后发酵10d,进行感观品评并测定RSV值。(2)EBC发酵:斜面菌种经扩培,接种于含有300mL麦汁的锥形瓶中,充分振荡后加入2.5L麦汁,倾入EBC发酵管。第1天10oC,2~6天11oC主发酵,每天取样测定发酵液中GSH及酵母胞内GSH。1.2.6发酵液中GSH浓度四氧嘧啶法测定发酵液中的GSH[14]。1.2.7酵母胞内GSH含量先将酵母细胞用蒸馏水洗涤2次后置于20oC冷冻后煮沸15min,然后在浓度为40%(V/V)的乙醇溶液中30oC下振荡抽提2h,测定上清液GSH浓度,除以相应细胞干重得到胞内GSH含量。1.2.8羰基化合物含量(TBA值)用以二烯醛类为代表的羰基化合物浓度来表征啤酒或麦汁中老化物质的含量[15]。取5mL经10000r/min离心的麦汁或啤酒样品,加入2mL含0.33%硫代巴比妥酸的50%