细菌染色技术

1项目二细菌的染色技术食品药品职业学院中药和生物系中药和生物系2细菌按细胞壁组成不同分为细菌染色技术基础知识－细菌基本结构：细胞壁革兰阳性菌：G+革兰阴性菌：G-3实验目的学习微生物涂片、染色的基本技术。掌握细菌革兰染色方法及其结果判断。熟悉革兰染色法的实际意义。学习无菌操作技术，巩固油镜的使用方法。细菌染色技术－示例细菌革兰染色法4实验原理细菌染色技术－示例细菌革兰染色法染色目的①细菌细胞与背景形成鲜明的色差，在显微镜下更易于识别。②鉴别细菌染色方法①单染色：用于观察细菌大小及形态；②复染色/革兰染色：用于鉴别细菌，指导临床合理用药；③其他方法：负染色、银染色等5实验原理细菌染色技术－示例细菌革兰染色法常用染料①碱性染料：美兰、结晶紫、番红等；②酸性染料：伊红、酸性复红等；③中性染料：如基姆萨氏（Gimsa）染料6实验原理-Gram’s染色原理细菌染色技术－示例细菌革兰染色法※G+细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；G-细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。※G+等电点（pI2~3）比G-（pI4~5）低，在相同pH条件下，G+所带负电荷比G-多，故与带正电荷的碱性染料结晶紫结合牢固，不易脱色。※G+菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；G-菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。7实验步骤细菌染色技术－示例细菌革兰染色法涂片、固定初染－结晶紫媒染－碘液脱色－95%酒精复染－复红油镜镜检②①③8实验步骤－①制片：自制标本片细菌染色技术－示例细菌革兰染色法涂片干燥固定9实验步骤－①制片：自制标本片细菌染色技术－示例细菌革兰染色法无菌操作tips10涂片过程的无菌操作11实验步骤－①制片：自制标本片细菌染色技术－示例细菌革兰染色法涂片※载玻片要洁净无油※涂片时，取菌切不可多,更不可将培养基刮下，涂抹要均匀，菌膜不宜过厚。以免影响显微镜观察tips12实验步骤－①制片：自制标本片细菌染色技术－示例细菌革兰染色法干燥※菌膜面朝上※玻片切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。tips13实验步骤－①制片：自制标本片细菌染色技术－示例细菌革兰染色法固定※菌膜面朝上过火焰外焰3-4次※不时以载玻片背面触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）※放置待冷后方好进行染色※研究微生物细胞结构应采用化学固定法tips14实验步骤－②Gram’s染色细菌染色技术－示例细菌革兰染色法初染结晶紫媒染卢戈碘液脱色95%酒精复染沙黄/番红革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。tips15tips2.4.5.水洗后勿使染料干凅，稍微甩干后直接进行下一步操作，以免染料结晶干扰显微观察7.水洗后务必等标本片干燥后方进行油镜观察，否则油水分层，难以清晰观察物象水流不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落，一般以冲洗下来的水基本无色为度。16实验步骤－③油镜镜检，结论细菌染色技术－示例细菌革兰染色法菌体紫色→革兰氏阳性菌（G+）金黄色葡萄球菌（G+）菌体红色→革兰氏阴性菌（G-）大肠埃希菌（G-）