荧光光谱

荧光&磷光法Fluorescence&phosphorescence荧光与发射光谱的关系荧光光谱法（FS）－原子吸收光能激发在返回基态时，所发射的荧光强度进行定量和定性的发射光谱法。FS&AES共性：均为发射光谱FS-光致发光，吸收具有选择性、激发态原子数不遵守波尔兹曼分布、发射光谱比较简单。AES－热致发光，激发态原子数遵守波尔兹曼分布、发射光谱比较复杂。某些物质受紫外光或可见光激发后能发射出比激发光波长波长的辐射，即荧光。光致发光激发光－待测物质分子成为激发态时所吸收的光发射光－处于激发态的分子回到基态时所产生的光。荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行定性或定量。Q，荧光物质的量子效率；I0，激发光强度；IA，样品吸收的光能；，荧光物质的摩尔吸收系数；b，光程，c，浓度，K常数荧光分析法(1)灵敏度极高（10-1010-12g/mL)（尤其是激光诱导荧光检测器，是目前灵敏度最高的检测技术）(2)谱线简单、干扰少（高选择性）(3)线性范围宽（3-5个数量级）（4）干扰因素多、复杂基体的样品测定有困难荧光分析法的特点溶剂溶液玻璃容器温度荧光衍生解决的途径：化学衍生－通过加入某试剂与待测药物发生化学反应或物理缔合，生产物能够产生荧光。A+BChvA+BA-Bhv荧光法的缺陷：可产生荧光的物质非常有限，就是只有少数化合物能发射荧光。光子衍生BasicprincipleoffluorescenceF,fluorescenceintensity;K,constant,I0,excitationintensity;,molarabsorbanceconstant;b,opticalpath;c,concentration.000lnAIFKQKQIbckcIIS2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫荧光&磷光法的基本原理激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为l‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l‘2l2l1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。激发光谱与荧光(磷光)光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；荧光的定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3I0lc=Kc设IF为荧光强度；I0入射紫外线强度；It为透过溶液后紫外线强度；Ia为溶液吸收紫外线；C为溶液中被测物质的浓度；l为溶液层的厚度。荧光的定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移（什么是stokes位移？）激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然蒽的激发光谱和荧光光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系1.分子产生荧光分析必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。四、影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；①溶剂不纯②溶剂的选择（极性）－测定荧光光谱时一定要注明所用溶剂。许多共轭芳族化合物，激发时发生了π→π*跃迁，其荧光光谱受溶剂极性的影响较大。荧光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移动四、影响荧光强度的外部因素2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加温度升高，非辐射的几率增强，荧光几率减少四、影响荧光强度的外部因素3.溶液pH的影响对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。四、影响荧光强度的外部因素4.溶液pH的影响悬浮物－光散射溶解氧－荧光淬灭pH值5.玻璃器皿的影响高度洁净浓度过大导致“自熄灭”（即荧光淬灭）效应即样品浓度超过一值后，荧光强度不再增加反而减小荧光淬灭Positive-SignalIndirectFluorometricDetectioninIonChromatography.Anal.Chem.1987,59,1362-1364.五、荧光光谱法仪器装置激发光源单色器样品池单色器检测器读出器五、荧光光谱法仪器装置注意：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。磷光检测激发光源UV-VIS氙灯、高压汞灯（365nm）分光系统滤光片（filter）吸收滤光片-可见光谱区使用干涉滤光片-全光谱区使用截止滤光片(cutofffilter)带通滤光片(bandpassfilter)全息滤光片（notchfilter）分光系统分光系统其他部件样品池单色器检测器其他类型荧光检测器激光诱导荧光检测发光二极管诱导荧光检测时间分辨荧光检测其他类型荧光检测器激光诱导荧光检测发光二极管诱导荧光检测时间分辨荧光检测光化学衍生荧光检测激光诱导荧光检测Laser-inducedfluorescencedetection激光LightAmplificationbyStimulatedEmissionofRadiation，LASER）typesMLODCLODAdvantagesdisadvantagesUV-vis10-1310-1610-310-8RelativeuniversalRelativelowsensitivityFl10-1510-1710-510-9HighersensitivityNotuniversalusedLIF-D10-1810-2110-810-13Extremelyhighsensitivity;ratherselectivityRelativelyexpensive;notuniversalRI10-1210-1610-410-7UniversalLowsensitivity;NotusedingradientoperationAmper.10-1810-2010-510-11highsensitive;HighselectivitynotuniversalConduct10-1510-1610-410-8RelativeuniversalRelativelowsensitivityMS10-1610-1710-810-9Moderatesensitivity;offersstructuralinformationRestrictioninbufferchoiceCL--10-810-12HighsensitivityNotuniversal激光的特点激光的发展历程1958年，美国肖洛和汤斯首次发现激光现象，并获得1964年的诺贝尔物理学奖1960年美国梅曼首次研制出红宝石激光器；1960年苏联尼古拉·巴索夫发明了半导体激光器；1990年代，高功率的激光激发器问世；2000年代，蓝光和紫外线激光二极管问世2009年，中国发现氟代硼铍酸钾晶体，可用于激发深紫外线激光，一旦成功应用，可令每片光碟的储存容量超过1TB；1MB=1024KB1GB=1024MB1TB=1024GB1961年，中国大陆第一台激光器在中科院长春光机所研制成功；1964年首次出现“激光”这一词语中国研制成功的新一代激光武器是国际上最先进的激光武器之一，可有效对付超高速战略侦察机；能使F－117隐形飞机的激光制导、红外导弹完全失灵。不同激光器性能的对比TypeLDLD-DPSSLGaslasersBeamdivergenceSeveralmrad2mrad0.5mradStability0.01%-1%Expectedlifetime5000h5000h1000hSize(cm3)101103104Operatingvoltage3V110220V110220VCost100$1000$2,000$MaintenanceNoNoYesLIF-D结构类型Confocalarrangement－共聚焦Orthogonalarrangement－垂直式Conlineararrangement－共线性ConfocalarrangementConlineararrangementPMTFilterDRObjectiveFlowcellFibercableLaserLI