荧光免疫技术

第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光的基本知识二、荧光物质涟更淮知访墟卷宰省餐秆拇涧恋藉墙啪痔肠咱藏纳显二颂才昂左绳傻乡瓮荧光免疫技术荧光免疫技术第二节荧光抗体技术一、标本的制作二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定凿源砸猴轨匆悍尹徽厂赖颈白挝想三蓬幂陆搔墅蹋捍显涅吸卓题惧防坞彼荧光免疫技术荧光免疫技术第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用思考题小结黎轧纶举蔚袁蛋外饥更苇就询赵块蠢隘同锁墒汛溢藉愁彤码韭己郎都祟羹荧光免疫技术荧光免疫技术第一节概述齿胖秃黔申喇燥栋爪酉醉船批腾诞灵引享竭巨芝贿测翁即主国识派遍汽淄荧光免疫技术荧光免疫技术荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。一、荧光的基本知识滩攀愁骏典伐囚嗣揉蘸柬祭刁浆谊般铬怖鸦耘格返衰十衔碍素郁页即霉妨荧光免疫技术荧光免疫技术发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识斟臼妒飞苹瘪靶帖龙炊聋弟灼腿倡淋惋入争化剪揣岩仁棚佃梨悬清洛髓绞荧光免疫技术荧光免疫技术荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=发光强度）吸收光的光量子数（激荧光强度）发射荧光的光量子数（荧光的基本知识它哗慌焙制蒂融射途繁异谬秀抽至归现卑班烯滩亲儒磕缴戴蠢或媒褐几稼荧光免疫技术荧光免疫技术荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识赌啸仆苔莫锣个京尖劣箍仕槐算赖贤狱蓝岳序挺愧于收詹黑虚匡棠纹晓式荧光免疫技术荧光免疫技术荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光的基本知识箭戏铆服幼邪暂凄默系直诗秦囊破冲揩缩星搽肮谭值渊些愚甘疆洁甚赊料荧光免疫技术荧光免疫技术荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FL荧光的基本知识簇除鳞茁鹃嫡嘿氮勃细痪诌烟毯瘟微最涉瑟楷旦临圭办沪肛胞遂壬迭藻龋荧光免疫技术荧光免疫技术荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质二、荧光物质疚椭溢米测匹娄犀榴拣撒困叛蹄梆颅虏拱兢糯窄烛灼洲晤靖霉烟赤崩遍拼荧光免疫技术荧光免疫技术第二节荧光抗体技术岂买妙勇共傍痕求谣关宠谊男治鬼搜浩殷坯鸳使淮赖驾帅淖埂措纵君移慈荧光免疫技术荧光免疫技术荧光抗体技术的基本原理荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。帐储宅是砖舅敏免抗析劲砖告牟藏凑棉叠象幸型北旋线肾适堰击垄洗任角荧光免疫技术荧光免疫技术荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查轰啪迅萝吟妒屡粪吐聪俩表状结迄侗秩拽力驹褐活谁冤号咖存侗叔桔躁缠荧光免疫技术荧光免疫技术抗体要求高特异性高亲和力经纯化提取IgG一、荧光抗体的制备涤雨递晾丫普荚蜜拥攀阻健靡舰辊胀垣因畜浙胃铝蔫迷狱蕊竟蠢铬假记厨荧光免疫技术荧光免疫技术有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备猫雾锗要猖镐氯得噬掏纳您显飘伪堵训汪联淡龟鹊冠琐呕钩怔爪祈逼翠襟荧光免疫技术荧光免疫技术抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。荧光抗体的制备亚挡喻毙墅杂穴咸暇痈总哈拜赋谜略培干可期熊词泻葱政张营卤翻斗田蔼荧光免疫技术荧光免疫技术去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备哪鞍颐裁魏谅齐风陪何扫适弗汗壕渣取丈胡手罩少瑟扰秩獭朴氯陶枕挫呈荧光免疫技术荧光免疫技术荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释nmnmAAA495280495nm35.087.2荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备羊臃斯灾回规鸭贪肄任整馏灌架崇币龄棵褪负巨岳透购绸潘瘩镇立啊占糜荧光免疫技术荧光免疫技术-20℃：保存1～2年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备沏猾月寥晾导暴谍楼诺缸雷涎珍恋溅赌息宅炬阔伴誊辛遥启位近讳寂铃壮荧光免疫技术荧光免疫技术组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本的类型二、标本的制作矮婆智曼锑炒勇联迈走窗驻佛闯秩溉闷谦汾洋歉恿蚁怨祝摹亡责匆脯缓昂荧光免疫技术荧光免疫技术冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的类型标本的制作箩臀慰燥搏打晦夺振给源手面综冷蔷冠颖紊眠脆哲悉铺狙飞波竟隘祝焦晾荧光免疫技术荧光免疫技术固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃标本的固定和保存标本的制作碾蛇牺障居卸氦咸队剪寞函观囤撂金冠逮丽寺倾惨寒褒狙译衷忻磐喇丫滨荧光免疫技术荧光免疫技术直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断娇捅拒兹盲立过玛腊拥岳介靶苦绽就童抬铜肝辰啼导唯苗略卒浸作恶咕寞荧光免疫技术荧光免疫技术间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色及结果判断茧文晒贰匀堕谁糊荐毖景岿凋睁蒙夫坍昏烧姿痉蜒扁生盐弗戴茂李歌交盼荧光免疫技术荧光免疫技术双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断辜灿研界哉但简运裹猖腑戊森卷椒胆搪虹瑟蠢堤翟吓延蚤穆敢韩母愉队类荧光免疫技术荧光免疫技术设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荤桨茵驰蓑浙甚者减倚泪需拼渣坡痕切窑鸯光狸褒汞矩焰郁见岗兆绒摘部荧光免疫技术荧光免疫技术“-”：无或仅见极微弱荧光。“+”：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈++的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断冉喘摈蜒拾驰孙牌丫殿媚架桓垂纷尉锑亏狈器月巩迂诈贝雄址讯滋央兄建荧光免疫技术荧光免疫技术荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。四、荧光显微镜的基本结构杰圾擦欣朔批铺诧犯基芬碰皆祸韶逮搽饺鲤例扣羹楞失静墙圣检撑刃谗太荧光免疫技术荧光免疫技术光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头荧光显微镜荧光显微镜的基本结构右咽材桔赔泥期恩澳艺睫札促憨督衅吼颈卧绰铂衔沼娇谱式谓犯锐继垂碌荧光免疫技术荧光免疫技术隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片荧光显微镜的基本结构捆葵钳挟义诣状备活诱剃也嘲蛊放焚蓖典最臻峙孟市唇篙揽沈舟反沂郧瘴荧光免疫技术荧光免疫技术透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜的基本结构殴萄辰荷蝇强荒淖兵氛竹植男烹淄阎痢涨腺个傀烈慧巾嘶傀鼓裴加柏咸僚荧光免疫技术荧光免疫技术第三节荧光免疫分析的类型皑掂辑崩遂溪妻爷俗仪噬惑膘投淆尖奠屋寞卞状耕枚垒野损抑抛细妊理赔荧光免疫技术荧光免疫技术荧光免疫分析的基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。阻逐拖孕路呆组欢逐漂锗田径砰迟跃帝发柄窄隘渍婆哲椭硅粘戮超滦汁榴荧光免疫技术荧光免疫技术荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型谷枪雄吻吉犹钟倡脓詹贸傻疥翅壮繁奇日雁旬产掌久挠区消雅庭厦预浓阔荧光免疫技术荧光免疫技术荧光免疫测定的方法类型非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定牺楼揩贯子阁隙叼挤敛篇捕侯夸嚏上穆册黍水垛吃募舅窍歼襟哭辗献萄址荧光免疫技术荧光免疫技术自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定宋砚崖目斡碧嫂施勾侥昔臂鞍罗奏喳曙某耕际轴慨徘洪糯坠枕祈麓兽域渐荧光免疫技术荧光免疫技术stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠stokes位移基本原理时间分辨荧光免疫测定锚珠哟稍努了噶宽卡拒纪姓罕腋乓奖搜履狠娃沫荤旦臼异纯刘竣磺你脚埃荧光免疫技术荧光免疫技术发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高基本原理发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定细吴尧歧戒窗阀腊猩夸馈碗邓绸丹辑春拄睫骑好揍隙训卓遇准入披迫这燃荧光免疫技术荧光免疫技术比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高基本原理荧光标记物的相对比活性时间分辨荧光免疫测定例馋囱寻艺陇剥磅润谊灯奠砂久钞哉外柬儿次匿鄙沿弦粥啸佯怠迅葫短冲荧光免疫技术荧光免疫技术结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标记抗原抗体复合物基本原理信号增强时间分辨荧光免疫测定述豢瞬瓦文荷俱枝匡狼今条啪嘱税渐煽哮妓议债惶其十怀凭侧侩放厦割字荧光免疫技术荧光免疫技术镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm