荧光分光光度计的原理及应用

2020/2/9荧光分光光度计的原理及应用2020/2/9一、分子荧光的产生1.电子激发态的多重度单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。第一节荧光分光光度法原理三重激发态T：电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。2020/2/92.分子能级与跃迁基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射。激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；磷光内转移外转移系间跨越延迟荧光传递途径辐射跃迁荧光振动弛预无辐射跃迁2020/2/9S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫2020/2/9二、激发光谱与荧光光谱1.荧光的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2020/2/92.荧光光谱固定激发光波长,化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。问题：荧光(磷光)的激发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。2020/2/9三、荧光强度和溶液浓度的关系1定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3I0lc=Kc（浓度高时如何？）2020/2/9标准曲线法定量：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法定量：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。2定量方法三、荧光强度和溶液浓度的关系2020/2/9四、荧光、磷光分析方法的特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少（4）可提供比较多的物理参数缺点：应用范围小。2020/2/9第二节荧光分光光度计的组成测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯?和高压汞灯，染料激光器检测器：光电倍增管。2020/2/9仪器光路图问题：参考光电管作用？2020/2/9第三节荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表2020/2/92020/2/92020/2/9作业•P143