酶工程

第六章酶工程Outline绪论§1酶的发酵生产§2酶的分离纯化§3.酶分子改造§4酶的固定化§5生物传感器基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术。酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。绪论定义：酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。酶的催化高效性通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶5×106molH2O21mol离子铁6×10-4molH2O2一、酶的定义•酶的高度催化效率（本质）•酶的催化具有高度特异性•酶促反应的条件温和•酶促反应无副反应•酶的催化受调控酶促反应的特点：一般催化剂反应活化能反应总能量变化酶促反应活化能非催化反应活化能初态终态能量改变活化过程酶促反应活化能的改变过渡态公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶(1947年诺贝尔奖)。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念(1986年诺贝尔奖)。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。(一)酶学研究历史二、有关历史TheNobelPrizeinChemistry1907forhisbiochemicalresearchesandhisdiscoveryofcell-freefermentationb.1860d.1917LandwirtschaftlicheHochschule(AgriculturalCollege)Berlin,GermanyGermanyEduardBuchnerTheNobelPrizeinChemistry1946fortheirpreparationofenzymesandvirusproteinsinapureform“forhisdiscoverythatenzymescanbecrystallized1904-19711891-19871887-1955RockefellerInstituteforMedicalResearchPrinceton,NJ,USARockefellerInstituteforMedicalResearchPrinceton,NJ,USACornellUniversityIthaca,NY,USA1/4oftheprize1/4oftheprize1/2oftheprizeWendellMeredithStanleyJohnHowardNorthropJamesBatchellerSumnerUreasecrystals(X728)Sumner,J.B.(1926)“Theisolationandcrystallizationoftheenzymeurease”J.Biol.Chem.69:435-441.Pepsincrystals(X90)Northrop,1930)Northrop,J.H.(1930)“Crystallinpepsin,1:Isolationandtestsofpurity”J.Gen.Physiol.13:739-766.酶——活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。enzyme—organicchemicalsubstance(acatalyst)formedinlivingcells,abletocausechangesinothersubstancewithoutbeingchangeditself.核酶的发现，改变了有关酶的概念，即“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。酶分两大类：•主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）•主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）酶的化学本质？酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。酶工程（二)酶工程研究简史（应用研究）1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等。解决的方法之一是固定化。（三）固定化技术的发展经历1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。分为：化学酶工程与生物酶工程。1.化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。2.生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。生物酶工程主要研究内容如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：三、酶的分类与命名(1)氧化还原酶Oxidoreductase(2)转移酶Transferase(3)水解酶hydrolase(4)裂合酶Lyase(5)异构酶Isomerase(6)合成酶LigaseorSynthetase酶的分类与命名1961年以前酶的命名采用习惯命名法，其依据的原则主要有：（1）根据酶所作用的底物命名。如催化水解淀粉的酶叫淀粉酶，催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶。有时还加上来源以区别不同来源的同一种酶．如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。（2）根据催化反应的性质及类型命名。如氧化酶、转移酶、水解酶等。（3）结合上述两个原则综合命名。如催化琥珀酸脱氢反应的酶叫琥珀酸脱氢酶等。在许多情况下，这种习惯的、非系统的或末指明催化性质的命名法是不甚合理的，经常会出现一种酶多个名称或一个名子多个酶共用的情况。为了适应酶学的发展，避免上述情况的发生，国际酶学委员会于1961年提出了一套系统的命名方案和分类原则。2.国际系统命名法按照国际系统命名法，每一种酶有一个系统名称和一个习惯名称。酶的系统名称应当明确标明酶的底物及催化反应的类型。例如乳酸脱氢酶的反应为：L-乳酸+NAD+=丙酮酸+NADH+H+这个反应的底物是L-乳酸和NAD+，类型是氧化还原反应。因此这个酶的系统名称为：L-乳酸：NAD+氧化还原酶。3、国际系统分类法及编号乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。核酸类酶（R酶）的分类•自1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定。•根据酶催化反应的类型，可以将R酶分为剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三类。•根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，发夹型R酶，含I型IVS的R酶，含II型IVS的R酶等。•根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子，可以将R酶分为分子内催化（incis，也称为自我催化）和分子间催化（intrans）两类。酶的分类与命名的基础是酶的专一性酶是一类具有催化功能的生物大分子，亦称生物催化剂。生物大分子蛋白质核酸(RNA)蛋白类酶核酸类酶(核酶)漫长的认识过程催化剂：反应前后不变化（ribozyme）四、酶的化学性质与催化特性酶促反应：底物：产物：酶的“活性”：酶失活：酶所催化的化学反应被酶催化的物质（S）；酶催化产生的物质（P）；酶所具有的催化能力；酶丧失催化能力目前研究内容(一）化学酶研究内容1自然酶的开发2酶的化学修饰3酶的固定化4人工合成酶的研究（二）生物酶研究内容1酶基因的克隆表达2酶的遗传修饰3酶的遗传设计（二）酶的组成酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅因子辅酶辅基金属激活剂金属离子作为辅助因子。单聚体蛋白酶蛋白寡聚体蛋白:谷酰胺合成酶多聚体蛋白:丙酮酸脱氢酶酶辅基:血红素辅因子辅酶:NAD,FAD,生物素等激活剂:金属离子胞内酶酶胞外酶酶的分子组成酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物(multienzymesystem)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ碱性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲酶的不同形式(四)活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心ActivesiteofChymotrypsin胰凝乳蛋白酶酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性(五)酶作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。(六)影响酶催化的各种因素3、酶活力单位1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。这