酶标仪基本知识及其检测原理

酶标仪基本知识及其检测原理2010-03-0723:35:27作者：佚名来源：互联网浏览次数：1网友评论0条酶标仪基本知识及其检测原理，文章简要介绍了酶标仪的原理和及应用。光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大子780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是为光照射到物上被物反射回来。绿色植物之所以是绿色，是为植物吸收了光中的红色光谱。酶仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。检测单位：光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量定量系。检测单位用OD值表，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表被检测物吸收掉的光密度，OD=10g（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度下述系：E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。OD值由下述公式计算：E=OD=C×D×E其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔子。在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造检测结果的不准确。此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。Anthos酶仪检测值计算仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换二进位数字信号，最大为4095.仪器定义没有光源下的透光值为0%，没有检测物的透光值为100%。则实际检测中，检测物的透光值均在0%一100%之间。透光值的计算如下：T=（Meas-Min）/（Max-Min）其中T为透光值，Meas为检测的二进位数值，Min为在0%的情下检测的二进位数值，Max为在100%的情下检测的二进位数值，举例如下：Anthos酶仪的中心定位仪器会自动对酶孔进行中心定位，中心定位是消除酶孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶仪进行检测时，仪器其实进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。光源的参照通道参照通道是用来校准由电压不稳或灯泡磨损带来的影响。酶仪的用途和其它提用ELISA试剂的测定，广泛用各种实验室，包括临床实验室。质量控质量控是试剂检测的重素。请按照试剂说明书的求进行质量控。空白校正有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书求进行。检测结果的解释由有相当多的素会影响检测的结果，如不同的酶板，检测试剂的积，都会造OD值的不，此，只有使用同一酶板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。酶仪的使用注意事项1、工作环境酶仪是一种精密的光学仪器，此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。根据DINVDE0871条例，仪器应放置在无磁和干扰电压的位置。依据DIN45635-19条例：仪器应放置在低40分贝的环境下。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。操作时环境温度应在15℃-40℃之间，环境湿度在15%-85%之间。操作电压应保持稳定。操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。保持干燥、干净、水的工作台面，以及足够的操作空间。2、操作注意事项酶仪的能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，此得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶仪之前是通过目测判断结果，操作过随意性较大，在使用酶仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造较大误差。在酶仪的操作中应注意以下事项：使用加液器加液，加液头不能混用。洗板洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。在测量过中，请勿碰酶板，以防酶板传送时挤伤操作人员的手。请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完后请洗手。如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照试剂盒的操作说明，以防对操作人员造损害。如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。不在测量过中闭电源。对试剂盒问造的测量结果的偏差，应根据实际情及时修改参数，以达到最佳效果。使用后盖好防尘罩。出技故障时应及时与厂联系，切勿擅自拆卸酶仪。酶仪及洗板机选购指南酶仪（MicroplateReader）是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断本中待测抗或抗原的浓度。酶仪广泛地应用在临床检验、生物学研、农业科学、食品和环境科学中，特别在近几年中，由大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶仪在生殖保健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技水提。目前国内许多计生站系统开了酶免检测项目，如：乙肝五项、爱滋病检测、优生优育系列检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如：某弓形虫检测试剂盒中，临界值规定为：阴性对照品的OD值×2.5,通过目测无法判断本孔的反应颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过另一孔颜色的2.5倍就不可能。国内多权威机构，如卫生部临床检验中心和计生育系统等多次强调酶仪的重性，并求酶联免疫检测试剂应使用酶仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶仪，并提供酶仪测定的原始数据，而各厂的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的项目往往是一些实质性的感染和病变（如：肝炎、爱滋病、优生优育等），判读更求严谨，由误诊引起的纠纷很难处理。另外，住院手病人前的丙肝、爱滋等EIA试剂检测是避免输血引起感染引发的医疗事故纠纷的必手段，正逐渐被许多单位所采用。我国免疫诊断方法有如下三种：酶免（EIA）、放免（RIA）和发光，在市上的情如下：各种方法所处市周期：放免衰退期，酶免长期，发光进入期。放免技由试剂的污染和有效期等问在国际和国内市逐渐被淘汰，而化学发光试剂和设备比较昂贵，使得其在国内的普及特别在计生系统普及需较长时间，EIA技稳定，试剂价格合理，供应充，酶免技在中国市处长期，此购买酶仪正合适宜。尤其提到的是，在中国的计生育和妇幼保健系统配备酶仪已经迫在眉睫。早在几年以前，世界卫生组织已建议对孕妇进行TORCH五项常规筛查，但是遗憾的是由缺乏酶仪和洗板机等设备，RCH的检测在中国还未能普遍开。TORCH感染在围产医学中称为TORCH综合症，由孕妇，胎儿和新生儿都易被感染，它已受到全世界妇产科和儿科的极大重视。妊娠期感染不仅危害母，往往还可对胎儿和新生儿产生严重影响。通过胎盘可引起子宫内感染而导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形，通过产道和母乳可引起新生儿感染。如累及神经系统可造不同度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪ORCH感染与优生优育有极为重的系。此，RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查。目前，TORCH的检测方法有放免（RIA）和酶免（EIA）。由放免方法需特殊仪器，且有放射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特异性强，灵敏度，简单快速，本低等优点，只配备有酶仪和其他相应的设备，多数普通实验室均可方便地开。很显然，尽快在计生系统普及酶仪等设备是一个迫切的需求。这项工作的落实将有助提诊治水，降低母婴发病率，从而提整个国民的健康素质。目前市上提供的EIA试剂越来越多，如：T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种癌症志物、伤寒、副伤寒等，另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和肝炎（如HBV、HCV），以及胎儿的抗，新生儿TSH的测定，疫苗反应等，市上也都有套EIA试剂盒供应。使用酶仪有利拓检测项目，提检测水，其社会效益和经济效益并举。酶仪的使用方法作为微孔板比色计的酶仪，其基本能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板能、温度控、定性和定量测定软件能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶仪进行测定操作时，有时难免会对酶仪的一些性能指产生迷惑，甚至对酶仪的应用产生错误的理解。如诸如使用酶仪较用肉眼观察测定的阳性率明显增加这样的问。一、测定波长一般酶仪的测定波长在400~750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD），其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L0时，最大吸收波长移至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min.此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。各种酶仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6~8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自的需选择。有时，有的实验室希望用酶仪作微量生化测定，故酶仪生产厂对其生产的酶仪扩了紫外检测能，此时需一个340nm波长滤光片。此时，酶仪的测定波长范围就为340-750nm或800nm。酶仪有单波长和双波长检测能有时使用者不知在什么情下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。二、测定的吸光度范围通常，酶仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定求。早期的酶仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司DragonWellscanMK-2的吸光度测定范围为0-3.5，而MultiskanAscent的吸光度测定范围（Abs）达0-4.0，在0-4.0范围，线性误差不超过±2.0%，在0.3-3.0吸光度范围内，测定精密度CV小±0.2%；3.0-4.0Abs范围内，测定精密度CV小士0.2%。此，对酶仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。三、光学系统酶仪的光学系统采用的是垂直光路多通道（通常为8或12通道，亦有单通道）检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶仪的光学系统能如何，均可通过酶仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等出来。光学系统好的话，则上述指也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接系。单通道可避免通道不同所致的差异。四、检测速度酶仪的检测速度是指其完比色测定所需的时间。检测速度快，有利提检测的精密度，即避免由测定过中，测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市上常见的酶仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内，如Labsys