2 植物组织培养实验室的构建

第一章实验室及基本操作一、植物组织培养实验室设计二、仪器和设备三、玻璃器皿和用具主要内容第一节实验室及基本设备一、实验室设计标准组织培养室包括洗涤室（区）药品室（区）准备室（区）灭菌室（区）储放室（区）操作室（区）培养室（区）AGlimpseofPlantTissueCulture１、洗涤室（区）玻璃器皿和塑料器皿１、洗包括用自来水、洗液、洗涤剂清洗２、干包括自然晾干和烘箱干燥２、药品室存放常用的化学试剂无机盐类（大量、微量）、有机物、生长调节剂等３、制备室培养基的配制生理生化测定４、储存室（区）存放配制后的培养基（低温）或未用完的培养基５、灭菌室即消毒室，是培养基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒灭菌的地方６、操作室也称接种室，是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。要求：干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整不易积污灰尘，地面平坦无缝便于清洗和灭菌。７、培养室是将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。主要设备：空调机、除湿机、换气扇、培养架、灯光等。植物组织培养材料移到田间前，先移到驯化室进行练苗，待生根成活后，再移到田间苗圃。二、仪器和设备（一）无菌操作设备１、烘箱：陈列于洗涤室作用：干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重2、灭菌锅陈列于灭菌室中类型：普通医用消毒锅大的高压灭菌锅作用：培养基、水和各种器皿的消毒3、超净工作台陈列于操作室（接种室）内类型：垂直式和水平式作用：无菌操作用（二）药品贮存和配制仪器设备1、冰箱陈列于制备室中作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。2、天平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂3、酸度计陈列于制备室中作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计（三）观察分析仪器设备显微镜陈列于观察室中类型：倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察电子显微镜病毒检测、细胞器变化体视显微镜形态分化的实体观察（四）培养设备1.空调置于培养室内作用：控制培养温度2.加湿器和去湿机置于培养室内控制培养室内湿度状况3.定时器置于培养室内控制光照时间4.培养架置于培养室内盛放培养物5.摇床和旋转床置于培养室内进行液体培养时用以改善气体状况6.恒温恒湿光照培养箱置于培养室内用于炼苗三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培养器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等2.分注器类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃仪器烧杯、量筒、移液管、移液枪、容量瓶、试剂瓶等（二）.器械类1.镊子类型：枪式镊子（接种、转移）、尖头镊子（茎尖）2.剪刀类型：大剪刀、小剪刀、弯头剪刀3.解剖刀类型：固定式和活动式4.接种针用来转移细胞或愈伤组织5.细菌过滤器用来去除细菌（高温的影响）第二节基本操作主要内容：一、洗涤二、灭菌三、无菌操作一、洗涤（一）重铬酸钾洗净法（二）洗涤剂洗净法（三）超声波洗净法（四）玻璃器皿的清洗二、灭菌（一）器具的灭菌1.干热灭菌法2.湿热灭菌法（高压蒸气灭菌）（二）培养基的灭菌1.湿热灭菌法（高压蒸气灭菌）2.过滤除菌法三、无菌操作关灯（10min）酒精消毒点燃酒精灯开始操作无菌操作步骤紫外灯灭菌（30min）第三节培养基主要内容：一、培养基的构成二、培养基的选择三、培养基的配制一、培养基的构成（一）水分类型：蒸馏水、纯水、自来水作用：构成培养基的主要成分（二）无机盐类类型：大量元素和微量元素作用：提供植物生长所需营养元素（三）有机营养成分1．糖类物质2．维生素类3．氨基酸类（四）植物生长调节剂1．生长素2．细胞分裂素3．赤霉素类（五）天然有机添加物质类型：椰子汁、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥作用：提供有机营养（六）凝固剂适用：固体培养基类型：琼脂条,琼脂,明胶等（七）其他添加物类型：活性炭、Vc等作用：防褐化注意！培养基一定要调pH值。二、培养基的选择（一）培养基的基本类型1.含盐量较高的培养基：种类：MS培养基、LS培养基、BL培养基、ER培养基等。特点：无机盐浓度高，特别是硝酸根离子、钾离子和铵离子含量丰富。2.硝酸钾含量较高的培养基类型：B5培养基、N6培养基、SH培养基。特点：培养基的浓度较高，铵态氮含量较低，但盐酸硫胺素（VB1）和硝酸钾含量较高。3.中等无机盐含量的培养基类型：Nitsch培养基、Miller培养基和H培养基。特点：大量元素含量约为MS培养基的一半，微量元素种类少但含量较高，维生素种类较多。4.低无机盐含量培养基类型：White培养基、WS培养基、HE培养基。特点：无机盐含量非常低，为MS培养基的1/4左右，有机成分也很低。（二）基本培养基的选择ＭＳ培养基：多数植物，但不适合生长缓慢、对无机盐类要求低的植物，尤其是不适合铵盐高会发生毒害的植物。B5培养基：豆类、木本植物。N6培养基：适合植物的花药培养。特点：KNO3和(NH4)2SO4含量高，但不含元素钼。White培养基：应用较广，非常适合生根培养和幼胚培养。WPM培养基：适合木本植物的培养。特点：氮含量比较低。注意！实际应用中要通过试验筛选。三、培养基的配制（一）培养基母液的配制1.基本培养基母液类型：四液式（钙盐最后加入）、三液式、五液式（钙盐和铁盐单独配制）。成分：大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。贮藏：2~4冰箱内贮藏。倍数：10X、100X。标记：配制倍数、母液号、日期等。2.植物生长调节剂单位选择：mg/L、mol/L；1~10mmol/L配制方法：2，4－D、IAA、IBA、GA3、ZT：95%酒精溶解后，加水定容。NAA：热水或95%酒精溶解后，加水定容。KT、6－BA：1mol/L的盐酸溶解后，加水定容。（二）培养基的配制步骤：取出母液；准备好用具。取容器（搪瓷缸），加入1/3~2/3左右的蒸馏水，加热至沸腾；用移液管量取所需量的母液加入一只干净的烧杯中，待琼脂完全溶解后加入称取定量的琼脂和蔗糖加入上述煮沸的水中并不断搅拌，直到完全溶解。调节pH值，用NaOH或稀HCl高压灭菌，（121℃，15min~20min）冷却，取出，待用第四节培养条件1、光照条件包括光照强度、时间长短、光照质量等有的材料培养需要光，有的则不需光；不同的植物所需的光照强度也不一样。一般1000-5000Lx/12-16h/天2、温度条件大多数植物23-32℃，一般25±2℃。低于15℃或高于35℃对植物的生长不利。3、湿度条件培养容器中湿度100％培养室的湿度一般70％-80％的相对湿度。4、气体思考题1、一个正规的组织培养实验室应具备那些房间？2、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？3、组织培养的环境条件有哪些？金花茶滤纸桥牡丹山茶在增殖蝴蝶兰试管苗开花情况非洲紫罗兰壮苗生跟