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转录组测序技术原理转录本AlltranscriptsAllmRNAs主要内容•样品检测•文库制备•ClusterStation•IlluminaSequencing•生物信息分析TotalRNA样品检测Agilent2100检测•OD260/280:1.8~2.2•RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7检测报告-合格样品检测报告-不合格样品主要内容•样品检测•文库制备•ClusterStation•IlluminaSequencing•生物信息分析第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓文库制备↓↓真核mRNA的纯化•mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化•Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。•mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。原核mRNA的纯化AmbionMICROExpressKitmRNA反转录•纯化过的mRNA样品加入1µl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。•加入1µl的stopbuffer终止反应。•加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀酶切产物。•末端修复•cDNA3′末端加A•Adapter连接不同方法比较主要内容•样品检测•文库制备•ClusterStation•IlluminaSequencing•生物信息分析主要内容•样品检测•文库制备•ClusterStation•IlluminaSequencing•生物信息分析新一代测序技术ReadLengthRunTimeOutput1×35bp~1.5days26-35Gb2×35bp~4days75-100Gb2×100bp~8days150-200GbThroughput:upto25GbperdayCTAGCTA5’-3’-…-5’GT合成第一个碱基Cycle1:按顺序加入反应试剂清除未反应的碱基和试剂激发碱基荧光并收集荧光信号去除阻断基团和荧光基团Cycle2-n:重复前面的步骤GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS测序技术OHFlowCell接头diolP7P5dioldiol模板杂交dioldiol延长dioldiol变性碱基片段杂交Clusterstation•剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)。•形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。•双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。•反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。主要内容•样品检测•文库制备•ClusterStation•IlluminaSequencing•生物信息分析生物信息分析基本信息分析•数据量产出：2Gbpersample•测序策略：HiSeq2000,PE91or101•插入片段大小：200bps•测序质量控制：Q20%80有参考基因组序列生物信息分析•基因结构优化•鉴定基因可变剪接•预测新转录本•SNP分析•基因融合鉴定有参考基因组序列信息分析流程Reads在基因组上的分布基因结构优化(Nagalakshmi,U.etal.,2008)通过转录组测序鉴定出酵母3’和5’UTR区域鉴定基因可变剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA鉴定融合基因新转录本预测GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)ReadsNEngJMed2009SNP分析DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptomeGenomeRes2010RiceTranscriptomeMaterialcallusrootatseedlingstage（14d）shootatseedlingstage（14d）flagleaves（2stages）panicle（3stages）MethodsRNASeq（paired-end&singleend）DGEsmallRNA（18-30nt）•基因功能注释•基因结构分析•鉴定出大量新转录本•可变剪接鉴定•基因融合鉴定无参考基因组生物信息分析•Unigene功能注释•Unigene的GO分类•Unigene代谢通路分析•预测编码蛋白框（CDS）•Unigene表达差异分析•Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析Denovoreads组装流程UnigeneGO分类UnigeneCOG功能分类基因表达差异分析N1:totaltagNumberinsampleAN2:totaltagNumberinsampleBX:GeneexpressionlevelinsampleAy:GeneexpressionlevelinsampleBReference:AudicS.etal.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes.19977(10):986-995Unigenepathway富集性分析Pathway富集性分析列表Thankyou