转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台，着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。关键词:RNA-Seq；原理应用；方法；挑战；发展前景Abstract：Transcriptomesequencing(RNA-Seq)isakindofhighefficiency,quicktranscriptomeresearchmethodsarechangingourunderstandingoftranscriptome.RNA-Seqtousehigh-throughputsequencingoftissuesorcellsofallRNAreversetranscriptionintocDNAlibraryweresequenced,throughstatisticalcorrelationreadparagraph(reads)numberswerecalculatedfromtheexpressionofdifferentRNAtranscripts,findnew;ifthegenomereferencesequence,thetranscriptsmappedtogenomic,determinethepositionofthetranscriptionshearcondition,moregeneticinformation,hasbeenwidelyusedinbiologicalresearch,medicalresearch,clinicalresearchanddrugdevelopment.ThispapercomparedseveralmethodsofplatformtranscriptomestudiesandseveralkindsofRNA-Seqinrecentyears,RNA-Seqfocusesontheprinciple,purpose,stepsandbioinformaticsanalysis,anddiscussestheRNA-Seqtechnologychallengesandfuturedevelopmentprospectandtheapplicationinrelatedfieldandothercontent,providethereferencefortheresearchandapplicationofthetechnologyfuture.Keyword：RNA-Seq;application;principle;method;challenge;developmentprospects前言：转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。遗传学中心法则表明，遗传信息在精密的调控下通过信使RNA(mRNA)从DNA传递到蛋白质。因此，mRNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的一个“桥梁”，而所有表达基因的身份以及其转录水平，综合起来被称作转录组(Transcriptome)[2]。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)[2,3]。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,了解转录组是解读基因组功能元件和揭示细胞及组织中分子组成所必需的，并且对理解机体发育和疾病具有重要作用。整个转录组分析的主要目标是：对所有的转录产物进行分类；确定基因的转录结构，如其起始位点，5′和3′末端，剪接模式和其他转录后修饰；并量化各转录本在发育过程中和不同条件下(如生理/病理)表达水平的变化[2,3]。在过去的十几年里，杂交技术的发展，再加上以标签序列为基础的方法的应用，第一次使研究人员对这一领域有了深入的了解，但毋庸置疑，随着新一代测序(Next-generationsequencing，NGS)平台的市场化，RNA-Seq(RNAsequencing)技术的应用已经彻底改变了转录组学的思维方式。RNA-Seq，即RNA测序又称转录组测序，是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术[3]，该技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP(编码序列单核苷酸多态性)，提供更为全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，RNA-Seq无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。本文在扼要介绍支持RNA-Seq的新一代测序平台的基础上，对RNA-Seq原理、特点以及到目前为止在研究真核生物转录特征方面的进展做一个较为全面的综述，并对其中有待进一步研究的问题进行了展望。1、转录组测序基本原理及平台[4]随着后基因组时代的到来，转录组测序成为率先发展且应用相对广泛的技术[5]。最早广泛应用测序技术为70年代的Sanger法，这也是完成人类基因组计划的基础，因其测序通量低、费时费力，科学家们一直在寻求通量更高、速度更快、价格更便宜、自动化程度更高的测序技术。自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术以及ABI公司的SOLiD技术为标志的高通量测序技术相继诞生[6]。相较于传统方法，该技术主要特点是测序通量高、测序时间和成本显著下降，可以一次对几十万到几百万条DNA分子序列测定，这使某物种全基因组和转录组的全貌细致分析成为可能，又称为深度测序，很多文献中称其为新一代测序技术，足见其划时代意义[7]。利用深度测序技术进行对某物种转录组分析的技术即RNA测序(RNA-Seq)，该项技术能够在单核苷酸水平对任意生物种的整体转录进程检测，不仅可以分析转录本的结构和表达水平，还能够发现未知转录本和稀有转录本，准确地识别可变剪切位点以及cSNP(编码序列单核苷酸多态性)，使得到的转录组信息更为全面，便于进一步注释分类[8]。与基因芯片相比，RNA-Seq无需预先设计探针即可对特定条件下任意物种生长发育阶段整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围，因而其成为目前深入研究转录组复杂变化活动的强大且颇具优越性的技术手段。一般来说，上述所有的高通量测序技术都能进行转录组测序，但不同平台和机型的测序方法及效果差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用侧重(表1)，这就要求在熟悉各种高通量测序仪内在技术特点的基础上进行选择应用；另一方面，也可尝试结合其他生物技术以获得更好的数据覆盖度和更为廉价的成本[9]。表1几种主要测序平台的比较[10]2、目前研究转录组的方法主要有(l)基于杂交技术,如CDNA芯片和寡聚核昔酸芯片；(2)基于测序技术,如早先基于Sange:测序的SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression)和MpSS(Massivelypara-llelSignaturesequeneing)。全长DNA文库和EST文库的测序分析。现在对CDNA、EST等的测序工作已升级为第二代测序技术新一代测序技术较sange测序技术通量更高、运行时间更短、测序片段更长现在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称为RNA-Seq。2.1、种主要的转录组研究方法的比较见表2，其中RNA一Seq具有以下优势：(l)通量高，运用第二代测序平台可得到几个到几百亿个碱基序列，可以达到覆盖整个基因组或转录组的要求；(2)灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本；(3)分辨率高，RNA一Seq的分辨率能达到单个碱基，准确度好，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题；(4)不受限制性，可以对任意物种进行全转录组分析，无需预先设计特异性探针，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及SNP、UTR区域[3,4]。表3是转录组测序技术与其他转录组学技术的比较，通过比较可以看出该技术应用的范围。3、RNA一Seq的主要用途[11]RNA一seq技术能够在单核昔酸水平对特定物种的整体转录活动进行检测,从而全面快速地获得该物种在某一状态下的几乎所有转录本信息。由于转录组测序可以得到全部RNA转录本的丰度信息，加之准确度又高，使得它具有十分广泛的应用领域。主要应用于：(l)检测新的转录本，包括未知转录本和稀有转录本；(2)基因转录水平研究，如基因表达量、不同样本间差异表达；(3)非编码区域功能研究，如microRNA、非编码长RNA(IncRNA)、RNA编辑；(4)转录本结构变异研究，如可变剪接、基因融合；(5)开发SNPs和SSR等。表2三种转录组研究方法的比较[10]表3RNA-Seq与其他转录组学技术比较3、RNA一Seq的主要用途[11]RNA一seq技术能够在单核昔酸水平对特定物种的整体转录活动进行检测,从而全面快速地获得该物种在某一状态下的几乎所有转录本信息。由于转录组测序可以得到全部RNA转录本的丰度信息，加之准确度又高，使得它具有十分广泛的应用领域。主要应用于：(l)检测新的转录本，包括未知转录本和稀有转录本；(2)基因转录水平研究，如基因表达量、不同样本间差异表达；(3)非编码区域功能研究，如microRNA、非编码长RNA(IncRNA)、RNA编辑；(4)转录本结构变异研究，如可变剪接、基因融合；(5)开发SNPs和SSR等。4、RNA一Seq的基本步骤[11]提取样本总RNA后,根据所测RNA种类进行分离纯化。再进而片段化为所用测序平台所需的长度(或反转录后片段化)，反转录后连接测序接头。接着利用PCR扩增达到一定丰度上机测序，直到获得足够的序列。所得序列通过与参考基因组比对或从头组装(denovoassembling)形成全基因组范围的转录谱。试验流程,如图1所示。图1RNA一eq试验流程4.1、送样要求1)请提供请提供OD260/280介于1.8～2.2之间，浓≥250ng/μl，总量≥40μg的总RNA，并确保RNA无降解，无污染；或提供浓度≥50ng/μl，总量≥400ng的mRNA。2)送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。3)样品保存期间切忌反复冻融。4)送样时使用干冰运输。5)质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。6)请填写完整的送样订单，并提供RNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。5、序言转录组技术在生物学、医学、农学中的应用随着第二代测序技术的迅猛发展，其高通量、快速、低成本的特点成为越来越多的生物学研究者在解决生物学问题时的首选，尤其在转录组测序方面更显示出极大的潜力。转录