转录调控-研究生教学课件

真核生物基因转录调控研究的进展和方法周建林一、真核生物基因表达调控的特点(略)二、真核生物基因转录调控三、真核生物基因转录调控的研究方法转录水平的调控顺式作用元件(cis-actingelement)反式作用因子(trans-actingfactor)顺式作用元件是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因非编码序列分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘子反式作用因子trans-actingfactor概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列,而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(阻遏)。类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导转录因子启动子(Promoter)概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件。一个基因可同时拥有一个及以上启动子；一般在转录起始点上游,位于(+1)及5’端上游100~200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素。；可与增强子共同控制转录起始和强度；发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。1.核心启动子：RNApolⅡ转录起始所必须的最少的DNA序列，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。2.上游启动子元件包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始转录点更远的上游元件。与TFⅡD结合成复合物后提高转录频率。启动子的研究方法研究内容：1、转录起始位点的确定2、启动子区域（顺式作用元件）的确定3、转录因子（反式作用元件）结合位点的确定4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用对基因转录的影响1、转录起始位点（TSS）的确定生物信息学预测TSS5´-RACE初步确定TSS的大概位置引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位TSS↓↓推荐使用Gene2Promoter软件（）和TSSW、TSSG（）预测转录起始位点和启动子区域的常用软件预测CpG岛常用软件：CpGPlot（）/FirstChoiceRLM-RACEKit(Ambion)GeneRacerRLM-RACEKit(Invitrogen)SMARTRACEcDNAAmplification(Clontech)Primerextension(引物延伸)S1nucleasemappingRNA5’DNA3’*5’3’RNA5’DNA3’5’3’PAGEAnalysisAddS1nucleasePrimerextensionandS1nucleasedigestion2、启动子区域的确定生物信息学预测启动子区域缺失突变荧光素酶活性分析↓↓克隆5´-flankingsequence并连接到报告基因载体上↓确定转录调控区域（启动子区域）↓Deletionmutagenesis(缺失诱变)Reportervector3、转录因子结合位点的确定(1)生物信息学预测转录因子结合位点(2)实验证实转录因子结合位点：EMSA/gel-shift,supershiftChIPDNaseIfootprinting推荐使用MatInspector软件（）Mapper://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.plSearchforevolutionaryconservedtranscriptionfactorbindingsites.rVista2.0()ConSite()Gelretardation(凝胶阻滞)/electrophoreticmobilityshiftassay(EMSA,电泳迁移率变动分析)ChIP（染色质免疫共沉淀）4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录的影响（1）定点突变→荧光素酶活性分析（2）过表达转录因子→测定目的基因的表达（3）干扰转录因子的表达→测定目的基因的表达（4）转基因动物定点突变增强子（enhancer）基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复序列。增强子特性1.增强效应非常明显10~200倍。2.与其位置、取向无关（上下游、距离）3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须4.有细胞组织特异性，需与特异蛋白因子作用5.无基因特异性6.要有启动子才能发挥作用BulgerandGroudine.2002.NatureGen.32:555-557ModelsforEnhancerAction–consistsofseveralgoodbindingsitesofTFs–thesitesarespatiallyclusteredtogether–thepatternofsitesisconservedCharacterizationofanenhancer?EnhancerElementLocator:PLuciferaseEPLuciferaseEPLuciferaseInsulator(绝缘子)一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。3.7InsulatorfunctioninImprintingTwolinkedImprintedGenes:Maternal[H19(on),Igf2(off)]Paternal[H19(off),Igf2(on)]H19Igf2Effectsofinsulatorsonenhancer–promoterinteractionsCTCFBSDB:aCTCFbindingsitedatabaseforcharacterizationofvertebrategenomicinsulators:CTCF11个与DNA结合的锌指结构域与绝大多数的ICRs以及CpG岛结合结合是甲基化敏感的具有绝缘子功能具有边界元素的功能，例如阻断异染色质的传播保护相应区域不被甲基化广泛表达，尤其在精母细胞中表达量高过表达抑制细胞的增殖基因定位于16q22,在癌症中常发生突变或缺失BORIS11个与DNA结合的锌指结构域结合位点与CTCF显著重叠？？？在癌症中被重新激活通常仅在睾丸中表达过表达促进细胞的增殖.基因定位于20q13,在癌症中常发生扩增Thankyou!