在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA

中国农业科学2005,38(2):394-398ScientiaAgriculturaSinica收稿日期：2004-02-09基金项目：国家“863”计划资助项目（2003AA2Z2006）和国家科技攻关资助项目（2004BA519A23）作者简介：王秀荣（1968-），女，黑龙江东宁人，副研究员，博士，主要从事禽流感快速诊断技术研究，Tel:[phone]，Fax：[phone]；E-mail:[e-mail]。于康震为通讯作者。在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA王秀荣，邓国华，于康震，石锐，刘丽玲，乔传玲，陈化兰，孔宪刚(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)摘要：对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）、A/Africanstarling/983/79（H7N1）和A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）。通过RT-PCR获得大约500bp的禽流感病毒基因cDNAs片段，克隆，从重组质粒扩增DNA片段，并点到玻璃载体上，制成芯片。在病毒RNA反转录过程中，用Cy5标记样品cDNAs。样品cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型，依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点，杂交信号与预期设想基本一致。结果显示，DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。关键词：禽流感病毒；基因芯片；亚型鉴定DetectionofcDNAofAvianInfluenzaVirusbyDNAMicroarrayWANGXiu-rong,DENGGuo-hua,YUKang-zhen,SHIRui,LIULi-ling,QIAOChuan-ling,CHENHua-lan,KONGXian-gang(AnimalInfluenzaLaboratoryofMinistryofAgriculture/NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology/HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001)Abstract:Arapidmicroarray-basedassayforthereliabledetectionofH5,H7andH9subtypesofavianinfluenzavirus(AIV)wasdeveloped.ThestrainsusedintheexperimentwereA/Turkey/England/N28/73（H5N2），A/Africanstarling/983/79（H7N1）andA/Turkey/Wiscosin/1/66（H9N2）.ThecDNAsclonewhichencodeapproximately500bpavianinfluenzavirusgenefragmentswereobtainedbyreversetranscriptionPCRtechnique,theDNAfragments,whichwerereamplifiedfromrecombinantplasmids,werespottedonaglass-boundmicroarray.Cy5-labeledfluorescentprobeswerehybridizedtothesesamplescDNAs,whichgeneratedfromvRNAduringreversetranscription.ThesesamplescDNAscontainedmultiplefragmentsofAIVincludingthehemagglutiningeneandmatrixgene.ThetypeofAIVweredetectedwiththematrixgene，andthesubtypesofAIVweredifferentiatedwithhemagglutiningene.Thearrayswerescannedtodeterminetheprobebindingsites.Thehybridizationpatternagreedapproximatelywiththeknowngridlocationofeachtarget.TheresultsshowedthatDNAmicroarraytechnologycouldprovideausefuldiagnosticmethodforAIV.Keywords:Avianinfluenzavirus；Microarray;Subtypeidentification流感病毒是属于正粘病毒科的RNA病毒，只有A型流感病毒可以在自然条件下感染鸟类[1]。A型流感病毒基因组含有8个单股负链RNA病毒节段，从禽类中分离到15个血凝素、9个神经氨酸酶亚型。A型流感病毒感染家禽后根据致病力不同可以分为高致病力和低致病力病毒，高致病力毒株对禽有高度致死力，死亡率可高达100%，这些高致病力毒株均属于H5和H7亚型，但不是所有的H5和H7亚型流感都是高致病力的毒株。低致病力毒株大多数属于H9N2亚型，在全世界范围引起广泛的疾病综合症，H9N2病毒引起的病症比H5和H7禽流感引起的病症要温和得多，主要局限于呼吸道症状，但是在其它疾病病原合并感染或环境因素的协同下，临床症状可能严重得多[2]。基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形2期王秀荣等：在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA395式排布在很小的载玻片等载体上，通过与标记的样品进行杂交，检测杂交信号的强弱进而判断样品中被检分子的数量。包被在固相载体上的核酸分子有序排列成微点阵（microarray）。目标是用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。自DNA芯片首次报道以后[3，4]，芯片技术对不同生物体的基因表达谱研究进行了改革，通过原位合成低聚核苷酸或者合成后自动点样技术制成芯片，可以大规模分析基因的表达情况[5，6]，最近还广泛用于药物筛选[7]、突变的检测[8]、遗传进化分析和基因组绘图[9]。由于芯片技术允许同时扫描成百上千的核苷酸序列，也显示了作为一种诊断方法的巨大潜能[10，11]。本研究在基因芯片平台上构建检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒（AIV）的快速实验技术模型。通过RT-PCR获得用于制备芯片的核酸分子，被检病毒样品常规处理后，在反转录过程中用cy5荧光标记，杂交后，根据试验结果分析制备禽流感病毒分型DNA芯片的可行性。1材料与方法1.1病毒本研究中所使用的毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室提供，在10日龄SPF鸡胚上增殖，病毒序列在GeneBank中的相关序列号见表1。表1本研究中使用的禽流感病毒1)Table1AvianinfluenzavirusesusedinthisstudyGenBank中病毒基因登录号GenBankaccessionno.毒株Viruses亚型SubtypeHAMA/Goose/Guangdong/1/96H5N1AF144305AF144306A/Africanstarling/983/79H7N1AF202232--A/Turkey/Wisconsin/1/66H9N2D90305--1)-表示在GenBank中没有登录NotavilableinGenBank1.2引物寡核苷酸引物用Oligo,version4.1设计，并在GenBank中分析序列的匹配情况。设计好的引物由宝生物技术有限公司(大连)合成，未进一步纯化（表2）。表2实验中所用引物Table2DNAsequencesofprimersdesignedforthisstudy编号Number引物名称Name参照序列Referencesequences引物序列Sequencesofprimers位置Position长度(bp)Size退火温度（℃）DenaturationtemperatureUni12AGCAAAAGCAGG12M-672UGAGCGAGGACTGCAGCGTAG236(20)1M-672LAF144306GTAGAAGGCCCTCTTTTCAA888(20)67254.35H1-619UGCAGGGGTATAATCTGTCAA1(20)25H1-619LAF144305CATCATTAGGATGGTGAATC600(20061951.55H2-669UGGGATTCACCATCCTAATGA598(20)35H2-669LAF144305TTCCCTTCCAACGGCCTCAA1247(20)66953.25H3-523UAATCCACTCAAAAGGCAATAGA1175(22)45H3-523LAF144305TTGGAGCACATGCATAAAGATA1676(22)52352.17H1-631UAGCAAAAGCAGGGGATACAA1(20)57H1-631LAF202232ATAATTTGGTCTGTTCTGTG612(20)63151.57H2-664UGATCAAGCACAGAACAGACC605(20)67H2-664LAF202232ATTTGCTTTTCAACCTCAGT1249(20)66452.37H3-532UAGTTAAACCGGCTCATAGAG1190(20)77H3-532LAF202232GGGTGTTTTTTCCAAACTTA1702(20)53251.69H1-597UCTGCACTGCTAATGGTAACA23(20)89H1-597LD90305CGGCATTCTTGTATAAGTCT600(20)59751.59H2-569UCATCCACCTACCGACACAGAA574(21)99H2569-LD90305TTTTGGGTAGATCCCTTGTC1123(20)56953.29H3-531UGACAAGGATCTACCCAAAAA1123(21)109H3-531LD90305ATTGGACATGGCCCAGAATAGAATAGGA1631(23)53152.5396中国农业科学38卷1.3RNA的提取按说明书进行。250μl病毒液，加入750μlTRIzol，震荡，混合，室温放置5min，继续加入200μl氯仿，震荡，混合，室温放置1~2min，12000r/min离心15min，把上清液移入另一个1.5ml离心管中，继续加入500μl异丙醇，室温下沉淀15~30min，12000r/min离心15min，弃上清，用75%酒精洗沉淀，抽真空干燥，加入20μlDEPC处理水溶解，-70℃保存，备用。1.4RT-PCR取5μlRNA，加1μl反转录引物，70℃解链5min，取出后放置冰上，继续加入5×FirstBuffer4μl、0.1mol·L-1DTT2μl、dNTPs2μl、M-MLV1μl、RNasin1μl、DEPC水4μl，37℃水浴1h，合成cDNA链。PCR为50μl体系，包括反转录产物2μl、上下游引物各0.5μl、10×Buffer5μl、dNTPs2μl、Taq酶0.5μl、水39.5μl，循环参数为95℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸6min结束。1%琼脂凝胶电泳分析。1.5用于点样DNA的制备分别扩增用于检测A型流感病毒M基因的1号，覆盖H5亚型HA基因的2、3、4号，覆盖H7亚型HA基因的5、6、7号，覆盖H9亚型HA基因的8、9、10号，新城疫、法氏囊、传染性支气管炎对照基因11、12、13号，以及阴性对照pUC18片段