2013级研究生-PCR

1PolymeraseChainReaction（PCR)聚合酶链反应DepartmentofbiochemistryandmolecularbiologyDNA，生命的蓝图ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20～30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。第一节PCR基本原理一、PCR的基本原理DNA体外的快速扩增技术11DenaturationPrimerannealingPolymerization模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数19第二节、PCR的过程（一）DNA模板的解链（变性）90℃～95℃，30s理论上，在90℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。（二）DNA单链与引物的退火（复性）55℃~65℃,30~45s引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性几率）;引物的最佳退火温度Tm-25℃。（三）引物的延伸（新链DNA的合成）70℃~75℃，30~60s（2kb)首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的，3’端没有固定的终止点，长短不一。第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点。N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACG-TPolymeraseChainReaction-PCRSpecificshortDNAprimerannealstostrandtobecopied5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TPolymeraseChainReaction-PCR5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TAPolymeraseChainReaction-PCR5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TACPolymeraseChainReaction-PCR5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TACGPolymeraseChainReaction-PCR5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TACGTPolymeraseChainReaction-PCR5’3’SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC**ACGT-TACGTAPolymeraseChainReaction-PCR5’3’高度的特异性：引物的限定，高温扩增。高度的敏感性：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、一根头发等），高效性（X106）。操作简便快速，易于自动化、程序化，方法稳定。对标本的纯度要求底：纯化或粗制的，新鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解的DNA。PCR技术的特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微克(μg)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。第三节、PCR扩增的基本方法（一）PCR反应体系1.仪器台式微量离心机基因扩增仪微量塑料离心管：0.5ml或1.5ml（经高压灭菌）微量加样器（pipetman）：20P、200P、1000P，电泳仪及电泳槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手套、Tip若干PCRAgarosegelelectrophoresisThefinalproductUVvisualisation3-4hours2.试剂与试样：一般选用50~100μl体积，模板核酸（template如：人基因组DNA0.1μg)扩增引物（primer一对,各0.2～1μmol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（四种：各20～200μmol/L)标准的缓冲液：10Xbuffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT）无菌双蒸水或三蒸水石蜡油或矿物油:30~50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）2.PCR反应试剂（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0.2-1mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。PCR反应体系1、10×PCRbuffer10μl2、dNTPmix各200μmol/L3、引物11μmol/L4、引物21μmol/L5、DNA模板50ng-1μg6、Taq酶2U7、加双蒸水至总体积为100μl（二）常规PCR的反应条件预变性：94℃300s（高温起动:充分变性，防止非特异性扩增）变性：90℃-95℃，30s-60s退火：55-65℃30s-45s延伸：70-72℃30-60s（2kb)25-35次cycle后，延长延伸（72℃，10min；充分延伸),冷却至4℃或加入EDTA至10mmol/L以终止反应。（三）PCR基本操作程序1.加样(1)向一微量eppendorf离心管（壁薄、管底扁平、深度适宜）中依次加入：10xPCRbuffer、ddH2O、dNTPs、Primers；102-105个copy的DNA样品；TaqDNA聚合酶0.5μl（混匀后,离心）。2.上机：设置循环程序，进行扩增。3.PCR产物电泳：凝胶的制备；点样与电泳；观察结果；作好记录或摄影，保存好实验结果。PCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围电泳缓冲液常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸电泳的指示剂二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速