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共 页 第 页修改序号主题1年号GB/T18204.1-2000GB/T18204.3-2013名称公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物发布机构国家质量技术监督局中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会1本标准规定了公共场所空气中细菌总数的测定方法本标准适用于公共卫生场所空气细菌总数测定。1GB/T18204的本部分规定了公共场所空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的现场采样与实验室培养方法。本部分适用于公共场所空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌以及嗜肺军团菌的测定，其他场所可参照执行。新增：注：本部分钟同一个指标如果有2个或2个以上检验方法时，可根据技术条件选择使用。2定义：本标准采用下列定义2术语和定义：下列术语和定义适用于本文件2.1撞击法：采用撞击式空气微生物采样器采样，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，从而使悬浮在空气中的带菌离子撞击到营养琼脂平板上，经37℃，48h培养后，计算每立方米空气中所含的细菌菌落数的采样测定方法。2.1新增：细菌总数公共场所空气中采集的样品，技术在营养琼脂培养基上经35℃～37℃、48h培养所生长发育的嗜中温性需氧和兼性厌氧菌落的总数。GB/T18204.3-2013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物更改确认表原内容修改后内容22.2自然沉降法：指直径9cm的营养琼脂平板在采样点暴露5min，经37℃、48h培养后，计数生长的细菌菌落数的采样测定方法。2.2新增：真菌总数公共产所空气中采集的样品，计数在沙氏琼脂培养基上经28℃、5d培养所形成的菌落数。2.3新增：β-溶血性链球菌公共场所空气中采集的样品，经35℃～37℃、24h～48h培养，在血琼脂平板上形成的典型菌落。2.4新增：嗜肺军团菌样品经培养在GVPC琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落。2.5撞击法：采用撞击式空气微生物采样器，使空气通过狭缝或小孔产生高速气流，从而将悬浮在空气中的微生物采集到营养琼脂平板上，经实验室培养后得到菌落数的测定方法。2.6自然沉降法：将营养琼芝平板暴露在空气中，微生物根据重力作用自然沉降到平板上，经实验室培养后得到菌落数的测定方法。3仪器和设备3新增：细菌总数3.1高压蒸汽灭菌器3.1新增：原理采用撞击法或自然沉降法采样、营养琼脂培养基培养技术的方法测定公共场所空气中的细菌总数。23.2干热灭菌器3.2新增：撞击法3.2.1仪器和设备3.2.1.1六级筛孔撞击式微生物采样器3.2.1.2高压蒸汽灭菌器3.2.1.3恒温培养箱3.2.1.4平皿：Φ90mm3.2.2培养基3.2.2.1营养琼脂培养基成分3.2.2.2制法：将蛋白胨、氯化钠、肉膏溶于蒸馏水中，校正pH为7.2～7.6，加入琼脂，121℃，20min灭菌备用。2内容3.2.3采样3.2.3.1采样点：见附录A3.2.3.2采样环境条件：采样时关闭门窗15min～30min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等，3.2.3.3采样方法：以无菌操作，使用撞击式微生物采样器（3.2.1.1）以28.3L/min流量采集5min～15min。采样器使用按照说明书要求进行。3.2.4检验步骤将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。3.2.5结果报告3.2.5.1采样点细菌总数结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m³（每立方米空气中菌落形成单位）。3.2.5.2一个区域细菌总数测定结果：一个区域空气中细菌总数的测定结果按该区域全部采样点中细菌总数测定值中的最大值给出。3.3恒温培养箱3.3自然沉降法2内容3.3.1仪器和设备3.3.1.1高压蒸汽灭菌器3.3.1.2恒温培养箱3.3.1.3平皿：Φ90mm3.3.1.4采样支架3.3.2培养基见3.2.23.3.3采样3.3.3.1采样点：见附录A.3.3.3.2采样环境条件：见3.2.3.22内容3.3.3.3采样方法：将营养琼芝平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min。3.3.4检测步骤见3.2.43.3.5结果报告计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数（CFU/皿）给出。3.4冰箱删除3.5平皿删除3.6制备培养基用一般设备：量筒，三角烧瓶，pH计或精密pH试纸等。删除3.7撞击式空气微生物采样器删除4培养基4真菌总数4.1营养琼脂培养基4.1原理采用撞击法或自然沉降法采样、沙氏琼脂培养基培养技术的方法测定公共场所空气中的真菌总数。2内容4.1.1成分删除4.1.2制法将上述各成分混合，加热溶解，校正pH至7.4，过滤分装，121℃20min高压灭菌，用自然沉降法测定时，倾注约15mL于灭菌平皿内，制成营养琼脂平板。用撞击法测定时参照采样器使用说明制备营养琼脂平板。删除4.2新增：撞击法4.2.1新增：仪器和设备见3.2.14.2.2新增：培养基4.2.2.1新增：沙氏琼脂培养基成分4.2.2.2新增：制法将蛋白胨、葡萄糖溶于蒸馏水中，校正pH为5.5～6.0，加入琼脂，115℃，15min灭菌备用。4.2.3采样见3.2.32内容4.2.4检验步骤将采集真菌后的沙氏琼脂培养基平皿置28℃培养，逐日观察并于第5天记录结果。若真菌数量过多可于第3天计数结果，并记录培养时间。4.2.5结果报告4.2.5.1采样点真菌总数结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采样体积换算成CFU/m³（每立方米空气中菌落形成单位）。4.2.5.2一个区域真菌总数测定结果：一个区域空气中真菌总数的测定结果按该区域全部采样点中真菌总数测定值中的最大值给出。4.3自然沉降法4.3.1仪器与设备见3.3.14.3.2培养基见4.2.24.3.3采样见3.3.34.3.4检验步骤见4.2.42内容4.3.5结果报告计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数（CFU/皿）给出。5操作步骤5β-溶血性链球菌5.1撞击法5.1原理5.1.1选择有代表性的位置设置采样点。将采样器消毒，按仪器使用说明进行采样。删除5.1.2样品采集完后，将带菌营养琼脂平板置36℃±1℃恒温箱中，培养48h，计数菌落数，并根据采样器的流量和采样时间，换算成每立方米空气中的菌落数。以每立方米菌落数（cfu/m³）报告结果。删除5.1.3选择撞击式空气微生物采样器的基本要求：a）对空气中细菌捕获率达95%。b）操作简单，携带方便，性能稳定，便于消毒。删除5.2自然沉降法5.2撞击法5.2.1设置采样点时，应根据现场的大小，选择有代表性的位置作为空气细菌监测的采样点。通常设置高度为1.2～1.5m。采样点应远离墙壁1m以上，并避开空调、门窗等空气流通处。5.2.1仪器与设备见3.2.12内容5.2.2将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min，盖上皿盖，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱中，培养48h。5.2.2培养基5.2.2.1血琼脂平板成分5.2.2.2制法：将蛋白胨、氯化钠、肉膏加热溶化于蒸馏水中，校正pH为7.4～7.6，加入琼脂，121℃，20min灭菌。待冷却至50℃左右，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀倾皿。5.2.3计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数。以每平皿菌落数（cfu/皿）报告结果。5.2.3采样见3.2.35.2.4检验步骤5.2.4.1培养方法：采样后的血琼脂平板在35℃～37℃下培养24～48h。5.2.4.2结果观察：培养后，在血琼脂平板上形成灰白色、表面突起、直径0.5mm～0.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光；镜检为革兰式阳性无芽胞球菌，圆形或卵圆形，呈链状排列，受培养与操作条件影响，链的长度在4个～8个细胞至十几个细胞之间；菌落周围有明显的2mm～4mm界限分明、完全透明的无色溶血环。符合上述特征的菌落为β-溶血性链球菌。5.2.5结果报告5.2.5.1采样点β-溶血性链球菌结果计算：菌落计数。记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m³（每立方米空气中菌落形成单位）。2内容5.2.5.2一个区域β-溶血性链球菌测定结果：一个区域空气中β-溶血性链球菌的测定结果按该区域全部采样点中β-溶血性链球菌测定值中的最大值给出。6嗜肺军团菌6.1原理采用液体冲击法采样、培养法定性测定公共场所空气中的嗜肺军团菌。6.2仪器和设备6.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100l/min，对于直径3.0μm以上的粒子的捕集效率应≥80%（或浓缩比≥8）。6.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，对于0.5μm以上粒子的捕集效率应≥90%。6.2.3离心管：容积50mL。6.2.4平皿：Φ90mm6.2.5CO2培养箱：35℃～～37℃。6.2.6紫外灯：波长360nm±2nm。6.2.7涡旋振荡器。6.2.8普通光学显微镜、荧光显微镜。6.2.9水浴箱。6.3试剂和培养基2内容6.3.1采样吸收液1——GVPC液体培养基6.3.1.1GVPC添加剂成分6.3.1.2BCYE添加剂成分6.3.1.3吸收液成分6.3.1.4制法：将活性炭、酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，加入GVPC添加剂（6.3.1.1）和BCYE添加剂（6.3.1.2），分装于灭菌后的离心管（6.2.3）中备用。6.3.2采样吸收液2——酵母提取液6.3.2.1吸收液成分6.3.2.2制法：将酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，分装于灭菌后的离心管（6.2.3）中备用。6.3.3盐酸氯化钾溶液溶液［с（HCL·KCL)=0.01mol/L］6.3.3.1成分6.3.3.2制法：将上述成分混匀，用1mol/L氢氧化钾调整pH=2.2±0.2，121℃下高压灭菌15min备用。6.3.4GVPC琼脂平板。6.3.5BCYE琼脂平板。6.3.6BCYE-CYE琼脂平板。6.3.7革兰氏染色液。6.3.8马尿酸盐生化反应管。6.3.9军团菌分型血清试剂。6.4采样6.4.1采样点：见附录A.2内容6.4.2将采样吸收液1（6.3.1）20mL倒入微生物气溶胶采样器（6.2.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴。6.4.3将微生物气溶胶浓缩器（6.2.1）与微生物气溶胶采样器（6.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。6.4.4按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m³～2m³。6.4.5将采样吸收液2（6.3.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（6.2.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴；在相同采样点重复6.4.3、6.4.4步骤。6.4.6采集的样品不必冷冻，但要避光和防止受热，4h内送实验室检验。6.5检验步骤6.5.1样品的酸处理：对采样后的吸收液1（6.3.1）和吸收液2（6.3.2）原液各取1mL，分别加入盐酸氯化钾溶液（6.3.3）充分混合，调pH值2.2，静置15min。6.5.2样品的接种：在酸处理后的两种样品（6.5.1）中分别加入1mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH为6.9，各取悬液0.2mL～0.3mL分别接种GVPC平板（6.3.4）。6.5.3样品的培养：将接种平板静置于浓度为5%、温度为35℃～37℃的CO2培养箱（6.2.5）中，孵育10d。6.5.4菌落观察：从孵育第3天开始观察菌落。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。2内容6.5.5菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板（6.3.5）和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板（6.3.6），35℃～37℃培养2d，凡在B