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0國立成功大學藥理學研究所碩士論文Metformin降血糖機轉之研究InvestigationofantihyperglycemicmechanismofMetformin研究生：黃瀞萩指導教授：鄭瑞棠博士洪正路博士中華民國九十二年六月12誌謝時光飛逝，轉眼就要畢業了。在即將踏出校園的此時，除了滿懷獲得學位的喜悅之外，對於陪伴我度過這些日子的良師益友們，心中更是充滿了感謝。本論文可以順利完成，首先要感謝的是指導老師鄭瑞棠教授，在實驗遇到挫折、困難時，恩師總是會適時的提出指導與幫助；學識上，恩師的學富五車與循循善誘，使我如沐春風；處世上，恩師的嘉言懿行與草偃風行，豐富我的人生經驗，在此致上由衷的敬意與感謝。此外，特別要感謝洪正路老師與張智仁醫師，在百忙之中還特地撥冗前來，指正我的缺失，使我的論文更加的完善。在這兩年中，感謝步青學長及紫麟學姐給予我學業上的協助與幫忙以及生活上的關心與鼓勵。此外，也要感謝實驗室的工作伙伴-稚萍學姊、芳宜學姊、雅芳，以及學弟妹-仕郁和佩芬。最後，謹以此論文獻給關心及疼愛我的家人，父親黃正德先生及母親劉素娥女士，感謝你們這些年來的全力栽培與照顧，讓我能夠無後顧之憂地追求學問、完成學業。此外，也要感謝我的先生宗穎、妹妹微分、哥哥盈源的支持與關心。3目錄中文摘要4英文摘要7縮寫表10第一章緒論12第二章實驗材料及方法18第三章實驗結果43第四章討論53第五章結論63參考文獻65附圖表73自述1034中文摘要(AbstractinChinese)5中文摘要為了解明metformin可能的降血糖機轉，使用胰島素缺乏的大白鼠來研究。不論在正常大白鼠或胰島素缺乏的大白鼠，metformin皆能以劑量相關的方式降低血糖。同時，在葡萄糖挑戰試驗，metformin會增加週邊組織對葡萄糖的利用率。文獻指出，在胰島素缺乏的大白鼠身上，藥物會刺激腎上腺分泌β-endorphin來活化周邊組織的嗎啡µ型受體，進而產生降血糖作用。因此，使用enzyme-linkedimmunosorbentassay技術檢測IDDM大白鼠血中β-endorphin的濃度。發現metformin會以劑量相關的方式增加血中β-endorphin的含量。而且，metformin的降血糖作用會被嗎啡μ型受體阻斷劑的naloxone或naloxonazine依劑量相關的型式阻斷。另外，在嗎啡μ型受體剔除的糖尿病小鼠，靜脈注射給予能產生降血糖濃度的metformin，卻看不到原先的降血糖作用；顯示metformin的降血糖作用與嗎啡μ型受體的活化有關。以口服的方式給予metformin至兩側腎上腺已摘除(bilateraladrenalectomy)的糖尿病大白鼠身上，血中β-endorphin的含量並無改變，且仍維持在高血糖的狀態；在STZ糖尿病大白鼠離體腎上腺(adrenalmedulla)，metformin卻不能促進β-endorphin的釋放。由此可知，metformin並非直接作用在腎上腺來促使β-endorphin釋放。目前已知，交感神經的活化可使β-endorphin釋放，於是，進一步探討metformin促進β-endorphin釋放之機制。用HPLC檢測Amine的實驗6中，發現metformin可抑制COMT之活性，減少交感神經傳遞物質的代謝。而且，metformin促進β-endorphin釋放之作用及降血糖作用均可被交感神經阻斷劑，prazosin或guanethidine解消。由此可知，在胰島素缺乏的糖尿病大白鼠，metformin會產生降血糖的作用，主要是透過抑制COMT活性，間接使體內交感神經傳遞物質增加；使交感神經活化，在腎上腺增加β-endorphin釋放，活化週邊組織的嗎啡μ型受體，因而增加肌肉葡萄糖的利用及抑制肝臟的糖質新生，於是，產生降血糖的作用。7英文摘要(Abstract)8英文摘要Inthepresentstudy,theantihyperglycemicactionandpossiblemechanismofmetforminwereinvestigated.Adose-dependentloweringofplasmaglucosewasobservedbothinthediabeticratslackinginsulinandWistarrats,afteroraltreatmentofmetformin.MetforminataneffectivedosesignificantlyattenuatedtheincreaseofplasmaglucoseinducedbyintravenousglucosechallengetestinWistarratsthatindicatedanincreaseofglucoseutilizationbymetformin.Inourpreviousstudy,wefoundthatβ-endorphinisresponsibleforproductionofhypoglycemiceffectinSTZ-diabeticrats.Increaseofplasmaβ-endorphininSTZ-diabeticratsseemsimportantforcompensationofhyperglycemia.Metforminattheeffectivedoseincreasedtheplasmaβ-endorphinlevelinSTZ-diabeticrats.Theplasmaglucoseloweringeffectofmetforminwasalsoabolishedbynaloxoneornaloxonazine.Plasmaglucoseloweringactionofmetforminatthedoseeffectiveindiabeticratswasdisappearedinopioidµ-receptorsknockoutmice.Theobtainedresultssuggestthatreleaseofβ-endorphinseemsresponsiblefortheloweringofplasmaglucoseinSTZ-diabeticratsbymetformin.Bilateraladrenalectomymadethelossoftheplasmaglucoseloweringeffectofmetforminandnoincreaseofplasmaβ-endorphinwasobtainedinmetformintreatedSTZ-diabeticrats.Metformincouldnotenhancetheβ-endorphinsecretionfromisolatedadrenalmedullaofSTZ-diabeticrats.Sympatheticactivationcouldinducereleaseofβ-endorphin.MetformincouldreducethemetabolismofsympatheticneurotransmittersbydecreasingCOMTactivity.Similartotheplasmaglucoseloweringeffect,theincreaseofplasma9β-endorphinbymetforminwasalsoabolishedbyprazosinorguanethidine.Theseresultssuggestthatreleaseofβ-endorphinfromtheadrenalglandseemsresponsiblefortheloweringofplasmaglucoseinSTZ-diabeticratsbymetforminthroughaninhibitionofCOMTactivityandactivationofsympatheticnerve.Activationofopioidµ-receptorsbythereleasedβ-endorphincanincreasetheutilizationofglucoseand/ordecreasehepaticgluconeogenesistolowerplasmaglucoseindiabeticratslackinginsulin.10縮寫表(Abbreviations)11縮寫表ARadrenoceptorBERβ-endorphinBSAbovineserumalbuminCOMTcatechol-O-methyltransferaseDMEMDulbecco’smodifiedEagle’smediumDOPAC3,4-dihydroxyphenylaceticacidFBSfetalbovineserumGLUT4glucosetransportproteinsubtype4HBSSHanks’sbalancedsaltsolutionHPLChigh-performanceliquidchromatographyHVAhomovanillicacidIDDMinsulin-dependentdiabeticmellitusi.v.intravenousinjectionKRBBKrebs-RingerbicarbonatebufferMAOmonomineoxidasePBGDporphobilinogendeaminasePBSphosphatebufferedsalinePEPCKphosphoenolpyruvatecarboxykinaseR.O.reverseosmoticRT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreactionSTZstreptozotocinSSCsodiumsalinecitrateTristris(hydroxymethyl)methylamine12第一章緒論(Introduction)13第一章緒論第一節前言隨著生活水準的提高，醫療衛生也隨之進步，國人平均壽命因而逐漸延長，可是，慢性病逐成為威脅國人健康的重要疾病。近年，糖尿病(diabetesmellitus；DM)一直高居國人十大死因之列(Chouetal.,1992)。糖尿病是一種複雜的慢性代謝性疾病，可發生於任何性別、年齡、種族及地區，乃是由於胰島素分泌或作用產生缺陷所引起的廣泛性代謝障礙(Harrisetal.,1987)。目前，糖尿病主要可分為兩類:一為第一型糖尿病(typeIdiabeticmellitus)，是指胰臟貝他細胞破壞，容易導致酮酸血症的糖尿病。貝他細胞破壞有自體免疫性和原因不明性(idiopathic)兩種，已知原因而非自體免疫的其他細胞破壞疾病，譬如血鐵症(Eiziriketal.,1993)。第一型糖尿病的特徵就是胰島素缺乏，這類病人必須依賴外來的胰島素，來防止酮酸中毒。治療第一型糖尿病的目標在於維持血糖在正常的範圍內，避免因血糖大幅度的改變而導致長期的併發症。另一類為第二型糖尿病(typeIIdiabeticmellitus)；乃由於胰島素作用阻抗和分泌缺陷所引起的。此型糖尿病病人的血糖常為逐漸昇高，因此早期並無典型糖尿病症狀，不易察覺。目前絕大部份糖尿病患均屬於第二型糖尿病。而且，大多數第二型糖尿病的病人都會伴隨胰島素抗阻性(insulinresistance)的出現。胰島素抗14阻性的形成主要是因胰臟蘭氏小島的β細胞過度地分泌胰島素(hyperinsulinamia)，造成骨骼肌、脂肪組織及肝臟等周邊組織對胰島素的敏感性(insulinsensitivity)降低；因而減低了組織對葡萄糖的利用率，造成高血糖的現象(Vigourouxetal.,2001)。在治療上，第一型糖尿病病人通常會施打胰島素再配合飲食治療及適量運動；至於第二型糖尿病病人，則以飲食治療及適量運動或加上口服