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Chapter5TheimmobileofEnzyme，CellandProtoplast酶、细胞、原生质体固定化游离酶的缺点酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活酶不易回收利用（酶的一次性使用）产物不易分纯，且难连续化生产酶的催化效率不够高Contentsofchapter5概述第一节酶固定化第二节细胞固定化第三节原生质体固定化2.什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水溶性酶活化基团固定化酶酶的固定化固定化酶概念指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法制备成的具有催化活性的水不溶性酶。2.固定化酶的制备方法吸附法离子键结合法共价键结合法交联法凝胶包埋法半透膜包埋法固定化方法非共价结合法化学结合法包埋法热处理法吸附法1.吸附作用力2.固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石3.优缺点（3）包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。只适合作用于小分子底物和产物的酶。凝胶包埋法（网格型）半透膜包埋法（微囊型）包埋法1）凝胶包埋法（网格型）将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。首先被采用的网格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂－－inactiation2）半透膜包埋法（微囊型）将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方法。界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。（3）结合法1）共价结合法☆通过共价键将酶与载体结合的方法。①结合方法ⅰ.将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶联反应；②与载体共价结合的酶的功能基团ε-氨基，α-氨基，α,β或γ位的羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。③载体天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等）无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）④优缺点ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂；酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。⑤载体活化方法A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．溴化氰法A．重氮法反应示意式NH2NaNO2/HClN2+Cl-酶-TyrN=NOHCH2酶重氮盐衍生物载体固定化酶A．重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进活泼的重氮基团。载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。B.叠氮法反应示意式OCH2COOHOCH2COOCH2CH3OH/HClOCH2CONHNH2NH2NH2（肼）OCH2CON3NaNO2/HClOCH2CONH-酶酶-NH2B.叠氮法对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。C．烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。OHO酶OD．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类（含有羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数大孔网状结构），生成亚氨基碳酸衍生物。D．溴化氰法亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。D．溴化氰法用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。共价结合法中载体的活化方法重氮法叠氮法烷基化法溴化氰法——含有苯氨基（亚硝酸）——含有酰肼基/羧基（亚硝酸）——含有羟基（三氯三嗪等多卤代物）——含有羟基（溴化氰活化）2）交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱（shiff）。第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶。（4）热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。步骤step总体积Volume(ml)总活力Totalactivity(u)总蛋白Totalprotein(mg)比活力Specificactivity(u/mg)纯化倍数Purification(fold)收率Yield(%)粗酶1040460070168.1乙醇沉淀9014257410.9DEAE-Sepharose柱层析11466292.0HiTrap-Q柱层析19422180.3下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。2736.913080.223314.5140726.714.88.551.410030109实验木瓜蛋白酶的固定化实验原理：载体：尼龙固定化方法：共价结合法尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。实验木瓜蛋白酶的固定化酶的固定化步骤：（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。（2）将尼龙布用3.65mol/LHCl溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性。（3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。实验木瓜蛋白酶的固定化酶的固定化步骤：（4）取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。（5）从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。实验木瓜蛋白酶的固定化酶活力测定：（1）溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。实验木瓜蛋白酶的固定化酶活力测定：（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。实验木瓜蛋白酶的固定化结果计算：固定化酶总活力活力回收=————————×100%溶液酶总活力固定化酶总活力数相对活力=——————————————×100%溶液酶总活力数-残留酶活力数3.固定化酶的性质（1）固定化后酶活力的变化——酶活力降低，反应速度下降原因：1）构象改变：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。2）空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用。3）内扩散作用：内扩散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。4）立体障碍：包埋时酶被高分子物质包埋，大分子不能透过膜与酶接近。（2）固定化酶的稳定性——大多提高1）稳定性大多提高热稳定性大多提高，有些反而下降对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对不同pH（酸度）稳定性，对分解酶的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性提高。2）稳定性提高的原因固定化后，酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；抑制自降解，提高了酶稳定性。青霉素酰化酶：固定化酶在pH5.5~10.3稳定，游离酶仅在pH7.0~9.0稳定。（3）固定化酶的最适温度变化——可能提高固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能变化也不大，有些会发生变化；由于固定化，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高；固定化酶的最适作用温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。（4）固定化酶的最适pH——发生改变酶经固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移；2）载体性质对最适pH的影响；一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH↑。一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH↓。1）pH对酶活性的影响：改变酶的空间构象影响酶的催化基团的解离影响酶的结合基团的解离改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。3）产物性质对最适pH的影响；产物酸性，其最适pH↑。产物碱性，其最适pH↓。产物中性，其最适pH不变。（5）底物特异性——发生改变对作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化；对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。（6）固定化酶的米氏常数（Km）——发生改变当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制，造成表观Km↑；由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。当载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km↓；当载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km显著增加。Km值又受载体的疏水性及溶液中离子强度的影响。——改变——可能改变——发生变化固定化酶的性质固定化酶活力固定化酶的稳定性固定化酶的最适温度固定化酶的最适pH固定化酶的底物特异性固定化酶的米氏常数（Km）——活力降低——大多提高——可能提高载体性质带负电荷：固定化酶pH↑带正电荷：固定化酶pH↓产物性质产物酸性：固定化酶pH↑产物碱性：固定化酶pH↓产物中性：固定化酶pH不变作用于小分子底物的酶－不变可作用于小分子及大分子底物的酶－改变载体与底物电荷相反－Km降低载体与底物电荷相同－Km升高5.4细胞和原生质体固定化1、细胞固定化细胞的固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化细胞：指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能反复或连续适用的活力。（1）固定化细胞的分类①按细胞类型分类固定化微生物细胞固定化植物细胞固定化动物细胞②按生理状态分固定化死细胞固定化活细胞固定化静止细胞和饥饿细胞固定化生长细胞（增殖细胞）：完整细胞、细胞碎片、细胞器：较适合于单酶反应：更适合于多酶反应（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点①优点Ⅰ.有利于提高细胞的存活率和稳定性；Ⅱ.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；Ⅲ.提高发酵稳定性，可在较长时间内反复和连续使用；Ⅳ.易与培养液与产物分开，利于产品的分离纯化，提高产品质量。（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点②缺点Ⅰ.利用的仅是胞内酶，副产物多；Ⅱ.细胞膜、细胞壁及载体存在扩散限制作用；Ⅲ.载体形成的孔隙大小影响高分子底物和产物的通透性。（3）固定化细胞的制备（P169-178）一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。固定方法吸附法包埋法：制备固定化细胞的主要方法。：凝胶包埋法是应用最广泛的方法。琼脂凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法角叉菜胶包埋法明胶包埋