基于fkbp12结构的药物发现l-1,4-噻嗪-3-羧酸

522中国科学B辑化学2006,36(6):522~533SCIENCEINCHINASer.BChemistry基于FKBP12结构的药物发现:L-1,4-噻嗪-3-羧酸衍生物的设计、合成及其神经营养活性*聂爱华肖军海王莉莉廖国超刘洪英任珅李松**(军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850)摘要以神经亲免素FKBP12为靶点,基于FKBP12,FK506与Calcineurin的复合物晶体结构,设计、合成和筛选能够特异地靶向FKBP12的只具有促神经生长作用的功能而不影响免疫系统的新结构神经退行性疾病治疗药物.结果显示化合物N308作为一种促神经生长和保护的候选药物具进一步开发的前景.关键词FKBP12L-1,4-噻嗪-3-羧酸衍生物设计合成神经营养活性收稿日期:2006-04-21;接受日期:2006-05-10*国家重点基础研究发展规划(批准号:G1998051107)和国家高科技计划(批准号:2002AA233051)资助项目**联系人,E-mail:[e-mail]神经退行性疾病防治药物的发现一直是一个重要的研究课题.20世纪90年代初期发现的神经亲免素FKBPs(FK506结合蛋白家族)为这类药物的研究和开发展现出新的希望[1,2].目前基于FKBPs结构的神经亲免素配体药物GPI-1485作为治疗帕金森氏症的药物已完成了二期临床实验,预计到2009年完成三期临床().本研究基于FKBP12(FKBPs家族成员之一)的结构,设计、合成和筛选高亲合力特异性的小分子有机化合物,研制具有新结构的神经退行性疾病治疗药物.1研究方法1.1化合物的设计根据FKBP12,FK506与Calcineurin的复合物晶体结构[3,4],应用计算机辅助药物设计的方法,确定出FKBP12靶蛋白中与神经退行性疾病相关的结构部位,并以此为结构基础构建小分子化合物虚拟库,利用DOCK筛选的方法,确定需要合成的定向分子库.1.2化合物的合成利用液相多步合成的方法,构建出目标分子的母核:L-1,4-噻嗪-3-羧酸;再应用液相平行合成的方法合成目标分子库.1.3化合物的生物活性评价应用分子水平的结合实验(生物质谱、复合物单晶X射线衍射实验)、PC12细胞分化模型、鸡胚背根神经节(DRG)体外无血清培养模型、6-OHDA毁损小鼠颌下腺交感神经末梢实验和免疫抑制作用实验对第6期聂爱华等:基于FKBP12结构的药物发现：L-1,4-噻嗪-3-羧酸衍生物的设计、合成及其神经营养活性523(a)是FKBP12,FK506,CalcineurinA和CalcineurinB复合物的晶体结构[3,4],也是FK506发挥免疫抑制作用的关键环节.FK506与FKBP12结合的部分为结合区,与CalcineurinB结合的部分为效应区(图1(b)).人们研究发现FK506具有神经保护和促神经再生的作用[5~7],同时也发现FKBP12与神经细胞再生过程相关,并且其在神经系统中的浓度高于其在免疫系统中的浓度[8],由此奠定了FKBP12作为寻找神经退行性疾病防治药物的重要靶点之一的基础.显然,由于FK506的免疫抑制作用,此化合物不能作为治疗神经退行性疾病的有效药物;但进一步研究表明FK506的神经营养活性只与其结合区的结构相关[9~11].本研究正是以此为基础,基于FK506与FKBP12结合的结构特征,设计出只具有神经营养活性而没有免疫抑制作用的小分子化合物并期望发展出可用于治疗神经退行性疾病的药物.结构研究的结果表明FKBP12三维结构为:一段短的α螺旋,围绕5条反平行β带,后者以右手螺旋形式缠绕于α螺旋周围.这5个带分别为残基2~8,21~30,35~38及46~49,71~76,97~106,α螺旋由残基57~63构成.FK506与FKBP12结合时,主要结合于α螺旋与β带之间的空腔中,大约有50%的FK506分子表面积被埋于空腔中,约为430Å2(图2(c)).空腔的入口是由残基39~46,50~56,82~95围成的环,这些残基大都含有芳香基团;空腔的四壁由Tyr26,Phe46,Phe99,Val55,Ile56的侧链构成,Trp59的吲哚环构成空腔的底部,作为FK506被包埋最深的哌啶环的作用平台(图2(d));哌啶环主要通过疏水及电荷相互作用结合于空腔中,连接于哌啶环上且相互处于反式的酯基和邻二羰基部分则通过氢键和偶极相互作用与FKBP12结合(图2(b),(c)).基于上述对FKBP12与FK506结合特点的分析,采用虚拟筛选的DOCK方法,筛选出如下杂环为目标分子的母核(图3(a)):确定了母核后,从ACD库中按分子量小于300选取小分子,用ProjectLibrary进行虚拟合成,以DOCK筛选(图3(b)~(d)),得到虚拟组合库.利用多步合成以及液相平行合成法对目标化合物进行合成.合成方案如下(图4).为了确保目标分子的绝对构型与所设计的一致,即C-3为R-构型且N-上的取代基与C-3上的取代基相互处于Trans-的位置,选取L-Leucine作为该合成的起始原料;同时仔细地选择合成的条件以保证在图1(a)FKBP12,FK506,CalcineurinA和CalcineurinB复合物的晶体结构;(b)FKBP12,FK506和CalcineurinB局部放大图524中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry图2(a)FK506的2D结构;(b)FK506与FKBP12的关键相互作用;(c)FKBP12(表面图)与FK506相互作用局部放大图;(d)FKBP12与FK506结合的活性位点表面图图3(a)新设计的FKBP12小分子配体的母核结构;(b)化合物库分子之一的2D结构;(c),(d):(b)中所示结构的分子与FKBP12的DOCK结果合成的过程中不发生外消旋化.X射线单晶衍射的结果[12]证明了目标物构型的正确性.图4中R的结构见实验部分,合成的27个目标物(表1)的结构都经MS,NMR,HRMS进行了确证.第6期聂爱华等:基于FKBP12结构的药物发现：L-1,4-噻嗪-3-羧酸衍生物的设计、合成及其神经营养活性525噻嗪-3-羧酸衍生物的合成路线(X=O,NH)a,C2H4O,0℃;b,HCl(H2O),90℃~95℃;c,CH3OH,0℃;d,DMF,Et3N,90℃~95℃;e,HCl(EtOH),0℃;f,p-toluenesulfonylchlo-ride,Et3N,0℃~5℃;g,i,LiOH(1mol·L−1),CH3OH,HCl(1mol·L−1),pH=2;h,k,D-(+)-camphorsulfonicacid,4-dimethyla-minopyridine,ROH或RNH2,r.t;j,m-chloroperoxybenzoicacid,CH2Cl2表1经由图4所示的合成路线产生的化合物化合物分子式收率/%a)HRMSb)化合物分子式收率/%a)HRMSb)9aC22H28N2O4S280.4449.05259oC20H24N2O4S292.9420.11799bC21H23NO4S250.4417.10679pC20H25N3O4S273.6435.13099cC21H31NO4S277.6425.17549qC28H31NO5S238.1525.16789dC27H29NO4S230.3495.15659rC27H28FNO4S276.0513.33349eC21H25NO5S289.7435.11729sC25H27NO4S373.8501.11009fC21H26N2O4S253.0434.13209tC21H25NO4S264.4419.11569gC23H30N2O4S256.3462.16089uC21H22F3NO4S293.0473.08609hC29H33NO6S290.1556.18209vC21H22F3NO4S245.8473.09149iC18H21NO4S368.1411.06719wC19H20N2O6S266.5436.07599jC26H27NO4S283.2481.14269xC25H25NO4S262.1467.12249kC28H30N2O5S274.3539.16039yC20H23NO5S275.1421.10809lC24H30N2O5S240.8491.16629zC22H27NO6S268.1465.12549mC25H32N2O5S290.2505.183911C20H30N2O7S284.4473.34629nC20H30N2O5S281.4443.1673a)指通过分离得到的收率;b)高分辩质谱2.2化合物的活性评价2.2.1分子水平的结合试验应用生物质谱法对这些化合物进行了分子水平的筛选[13].结果发现化合物N308(表1中所示的化合物9n)能够与rhFKBP12形成非共价键复合物,其结合强度虽低于FK506,但通过竞争实验发现其结合位点与FK506的相同.为了进一步了解化合物N308与rhFKBP12形成非共价键复合物的详细情况,通过共结晶的方法使化合物N308与rhFKBP12形成复合物单晶[12],并对复合物单晶进行结构解析进一步证明了其结合位点与FK506-FKBP12非共价键复合物的526中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry结合位点相同,这些结果也与DOCK筛选的结果(图5(a)~(e))一致.2.2.2PC12细胞分化实验PC12细胞来源于大鼠肾上腺髓质瘤(嗜铬细胞瘤),由于其能分泌多巴胺和少量的肾上腺素及在NGF作用下长出突起形成神经元样细胞,被广泛用于神经系统疾病的体外研究.本研究以PC12细胞为体外模型,观察受试化合物是否能促进NGF(2ng/mL)诱导的PC12细胞分化.从图6,7中可以看出,化合物N308与阳性对照药FK506一样,具有促进NGF(2ng/mL)诱导的PC12细胞分化作用,并有明显的剂量依赖关系.2.2.3鸡胚背根神经节(DRG)体外无血清培养模型应用鸡胚背根神经节体外无血清培养模型对目标化合物的促神经生长作用进行筛选,结果表明化合物N308在所示的浓度下有显著的促鸡胚背根神经生长作用(见图8).2.2.46-OHDA毁损小鼠颌下腺交感神经末梢实验应用6-OHDA毁损小鼠颌下腺交感神经末梢实验筛选目标化合物的神经保护作用,结果表明化合物N308在5mg/kg剂量下,能增加小鼠颌下腺NE释放量,提示化合物N308对6-OHDA诱导的小鼠颌下腺交感神经末梢损伤具有保护作用(图9).2.2.5化合物N308免疫抑制活性研究体外试验(invitro)观察了N308在10和100nmol·L−1浓度下对Balb/c小鼠脾细胞存活和增殖的影响.实验表明化合物N308在10和100nmol·L−1浓度下均对小鼠脾细胞存活无明显影响(图10(a)),但可以促进ConA诱导的脾细胞增殖反应(图10(b));阳性药物FK506在10和100nmol·L−1浓度下对脾细胞增殖具有明显的抑制作用(图10).图5(a)N308的2D结构;(b)N308与FKBP12(活性位点表面图)的DOCK结果;(c)N308酰胺基中的氢原子与Tyr26的羟基氧原子、Asp37的羧基氧原子之间形成氢键(以红色虚线标出,以下同);N308酯基中羰基氧原子与Arg42的胍基之间形成氢键;(d)N308中磺酰基中的一个氧原子与Ile56中酰胺基中的氢原子之间形成氢键;(e)显示出了N308中磺酰基中的另一个氧原子与Trp59,Tyr26和Phe46中芳香环之间的偶极相互作用(以蓝色虚