基因工程制药-苏州培训20170520

基因工程制药简介张义浜2017-05-20生物技术现代生物技术现代生物技术自然更新组织培养与提取酿造技术人工育种基因工程酶工程细胞工程发酵工程早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间产品研制国家用途上市国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素（IL）1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国批准年份药品批准年份药品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰岛素、Anti-CD3鼠源单抗1992IFN-α2a2000人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表皮生长因子（EGF）、EGF衍生物霍乱疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液重组葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2004重组人p53腺病毒注射液抗EGFR人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重组链激酶（γ-SK）、EPO2005重组人脑利钠肽、重组人血管内皮抑素重组人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生长激素（GH）痢疾疫苗、牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2006重组TNFR-Fc融合蛋白上游阶段选择表达系统主要考虑：必须保证所表达的蛋白质具有生物活性考虑基因工程蛋白质表达量的多少蛋白质分离纯化的难易程度下游阶段基因的克隆工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的方法:cDNA克隆示意图DNA聚合酶ImRNA反转录酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1序列已知；直接成本DNA合成仪基因的克隆与表达一、宿主菌的选择宿主菌应满足以下要求：①具有高浓度、高产量、高产率；②能利用易得廉价原料；③不致病、不产生内毒素；④发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑤容易进行代谢调控；⑥方便重组DNA操作；⑦产物容易提取纯化。包涵体包涵体（3）链霉菌重要的工业微生物。不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有一定的糖基化能力2、真核细胞（1）酵母特点：①真核生物细胞，表达产物能糖基化；②基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；③世代时间短，繁殖迅速；④基因操作与原核生物相似；⑤建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。（2）丝状真菌特点：真核生物和原核生物基因表达过程示意图克隆载体:克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加表达载体:将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质插入型载体:将外源基因或DNA插入其中置换型载体:切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。载体（vector）质粒（plasmid）质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。原核细胞表达载体非融合型pKK223-3分泌型PINⅢ-ompA1融合蛋白表达载体pGEX结构包涵体型pBV220结构融合蛋白表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体包涵体型表达载体已在酿酒酵母中表达的重组蛋白种类名称疫苗乙肝病毒表面抗原疟原虫环子孢子蛋白HIV-1外壳蛋白诊断试剂丙肝病毒蛋白HIV-1抗原治疗用蛋白质药物上皮生长因子胰岛素类胰岛素生长因子血小板源生长因子胰岛素前体成纤维细胞生长因子集落刺激因子1抗胰蛋白酶凝血因子XIII基因工程菌的培养基因工程菌发酵的基本操作方式有：分批培养分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限半连续培养（补料分批）在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物连续培养不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。透析培养固定化培养基因工程菌培养方式补料分批培养补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。连续培养连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。但由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。透析培养透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响固定化培养基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。主要表现在重组质粒的不稳定性，两种表现形式：1）结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失2）分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸基因工程菌不稳定性的可能产生机制：•受体细胞中限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解•外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序•重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配重组质粒逃逸的基本原因•受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排培养基比生长速率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达遗传特性影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上发酵工艺1.培养基一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较基本培养基快。培养条件对基因工程菌稳定性的影响2.比生长速率基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和pH下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。3.限制性基质一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响4.pH和溶解氧pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。5.外源基因的表达外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定；尤其当外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。例如，吲哚丙烯酸（IAA）是trp操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的IAA，发现随IAA量的增加，pVH5带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中Trp－的比例上升。电泳分析表明60%～70%色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。1、改进载体受体系统以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：1）将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞2）正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内3）将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因）提高基因工程菌稳定性的策略2、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素；加入大量的抗生素会使生产成本增加；添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间；添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高提高基因工程菌稳定性的策略3、分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。提高基因工程菌稳定性的策略4、控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数5、优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定提高基因工程菌稳定性的策略6、控制培养条件有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。例如研究表达干扰素的大肠杆菌W3110(pEC901)在不同比生长速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大.提高基因工程菌稳定性的策略7、固定化培养固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。提高基因工程菌稳定性的策略基因工程药物