基因芯片在食源性致病微生物检测中的应用

基因芯片在食源性致病微生物检测中的应用生活中，因微生物引起的食物中毒事件频有发生，食品微生物检测和研究对人民的安全饮食极为重要。自二十世纪八九十年代以来，随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。食品微生物检测和研究在快速自动化采样和检测方面取得了较快的进展,生物传感器、基因分析及酶联免疫分析等技术在食品微生物学检测中被广泛应用[1]。然而，上述生物学技术一般每次仅能检测一种食源性微生物，无法全面分析检测食品中所存在的微生物的种类、分布及数量，这是食品微生物学亟待解决的一个重要问题。进入本世纪后，随着分子微生物生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针(Nuclearacidprobe)和聚合酶链反应(Polymerasechainreaction)以及新近发展起来的基因芯片（DNAmicroarray）技术的建立与广泛应用，为全面快速准确地分析鉴定水体、空气、土壤和食品等环境中的各种微生物提供了一种崭新的技术工具和平台[2]。目前,基因芯片已广泛应用于包括环境微生物、微生物生态,人类、兽医、食品和植物的诊断,以及水质监控、工业微生物等等[3,4]，这里本文将着重讨论基因芯片应用于食源性致病微生物检测的基本原理与步骤，包括食品微生物采样、基因组DNA分离纯化、PCRE扩增、芯片杂交等过程的要求，以及该技术的应用现状和前景。1基因芯片检测微生物的基本原理与步骤1.1基因芯片检测微生物的基本原理基因芯片是20世纪90年代中期从传统的基于膜杂交检测DNA的SouthernBlot和和检测RNA的NorthernBlot技术进一步发展而来，但它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体，比传统检测方法在节省人力、时间、费用的同时，能对研究对象进行高通量分析，被评为1998年度世界十大科技进展之一。基因芯片作为一种快速、高通量的研究工具最初主要应用于全基因组的表达分析，随着研究的不断深入，它已在微生物的检测中得到应用；依赖于高度特异的探针，能够在种属水平上同时区分上至几千种微生物。首先利用待检测微生物的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针（寡核苷酸）点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测微生物靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物[5]。基因芯片具有集成度高，可以同时对多种目标菌实现高通量的并行检测，一次实验即可得出全部结果；操作简便快速，整个检测24h基本可以出结果，而传统方法一般需4-7d时间；该技术将核酸探针、聚合酶链反应和分子杂交三者有机的结合在一起，特异性强，敏感性高，越来越受到广大检测部门及科研者的重视。1.2芯片探针与PCR引物的设计、合成基因芯片检测不同于传统的基因分析方法，要求同时检测数十种乃至上百种微生物的基因，从而对芯片探针及PCR引物的设计提出了较高的要求。由于细菌16SrRNA高度保守,早在1987年就被提倡用于细菌的分类学,被誉为细菌的“活化石”，目前几乎所有已知细菌的16SrDNA的碱基序列已被测定，因此，目前大多利用16SrRNA作为芯片检测的靶基因[6]。16SrDNA由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,可变区在不同种属间有不同程度差异,可变区与保守区交错排列。许多研究者都以16SrDNA为靶基因建立平行检测多种病原菌的微阵列技术,在其保守区设计通用引物进行细菌的基因扩增,针对特异区设计寡核苷酸探针,点在基片上制成寡核苷酸微阵列。但由于16SrDNA的高度保守性,探针的特异性设计比较困难,常产生假阳性结果,对于某些16SrRNA序列基本相同的致病菌，可利用特异的致病基因，如沙门氏菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的23SrRNA基因、志贺氏菌的virA基因作为检测靶基因设计引物和探针[7]。PCR扩增引物及芯片探针一般均采用DNA合成仪体外合成，质量符合要求的探针再进行5'端氨基化修饰，以便与醛基包被的基片表面结合，从而将探针固定在基片上。1.3芯片的制备、靶标标记、杂交检测和结果分析针对设计的寡核苷酸探针的特点，目前微生物检测基因芯片多采用醛基化处理(使载体活化)的玻片。将预先人工合成的探针寡核苷酸探针按照合适的阵列分布和排列采用全自动点样仪点制在玻片载体上，在对芯片进行预处理，除去芯片表面未结合的探针后即可进行杂交检测。在正式杂交检测前应通过预试验以确定合适的杂交温度、杂交时间、模板加入量及洗脱条件，以便提高杂交效率，增加芯片检测的敏感性。在标记靶标时，由于在PCR扩增时加入荧光标记的Dntp容易对后面的杂交产生高背景，所以目前多采用在引物末端进行荧光修饰的方法标记靶标，这样获得的PCR产物可以不经过纯化直接用于杂交检测。为进一步提高检测的灵敏度，在对靶标进行PCR扩增标记过程中，可采用不对称扩增，通常在反应体系中标记引物的浓度为未标记引物的20倍，以提高与探针有效杂交的目标基因组的浓度，增大荧光信号。芯片杂交信号的检测一般均采用各种型号的芯片检测仪测定芯片中各点阵的荧光强度，然后再用专门的分析软件对结果进行分析和判读。2样品的采集、富集和微生物DNA分离纯化2.1样品的采集和富集食品中的微生物分布具有随机性、低丰度、种类广的特点,这些都对样品中目标微生物DNA的分离纯化带来了一定困难。利用基因芯片技术检测食品中的微生物首先需要对样品进行富集培养，以增加样品中微生物的绝对数量，以满足低丰度微生物的检测要求；食品卫生检测工作日常检测的食品种类多、样品数量大，因而在富集培养时，通常多采用对检测目标菌株进行选择性培养，以此来初步筛选及分离纯化目标微生物，提高检测的准确性。由于在培养基中，食品基质的量远远多于待检测微生物的量，这会严重影响微生物基因组DNA的分离，因此在采集样品时，首先须对样品进行离心、过滤以尽量除去基质，提高微生物的纯度。近年来，许多物理或化学分离纯化方法被成功引进到食品微生物检测工作之中。如Lucore[8]等利用金属氢氧化物对细菌的选择吸附作用浓缩食品微生物，Cheng[9]等利用某些液体食品的低导电性采用双向电泳分离细菌。2.2微生物DNA的分离纯化食品中微生物靶核酸浓度低、异质性强，同时PCR扩增又对基因组DNA的纯度要求高，因此分离纯化微生物DNA是包括基因芯片技术在内的食品基因分析检测的难点。通常细菌核酸提取是采用的碱裂解法，但对大多的革兰氏阳性菌不能起到很好的效果，需另外添加溶菌酶，且碱裂解会同时裂解基质核酸，带来不必要的污染。北京博奥生物公司新近开发了一种专门针对细菌的通用型细菌DNA快速提取器，一次可同时处理36份样品，自动化程度、敏感性高，对革兰氏阴性和阳性菌同时适用，已用于水果、蔬菜、奶制品、鱼类等多种动植物性食品的卫生检测。3基因芯片用于食品微生物检测的具体实例利用北京博奥公司开发的食源性致病微生物检测试剂盒对鲜猪肉进行致病微生物检测，该试剂盒可同时对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、致泻性大肠杆菌O157:H7、空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌进行检测，检测灵敏度达，检测的假阳性率为假阴性率为0%。Ⅰ、样品的前增菌取25g鲜猪肉放入含有225mL营养肉汤（NB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中37℃培养10h，同时将另一份样品经同样处理后于37℃微氧环境（5%O2、10%CO2、85%N2）增菌48h，该样品用于空肠弯曲杆菌的检测。Ⅱ、细菌基因组DNA提取利用博奥公司生产的通用型细菌DNA快速提取试剂盒对待检测样品进行基因组DNA提取，具体步骤参见：对提取的基因组DNA提取用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。Ⅲ、对多重不对称PCR扩增PCR扩增参照试剂盒说明书进行，50µlPCR体系中，10×PCRBuffer终浓度为1×、dNTP浓度0.8mmol·L-1、标记浓度1µmol·L-1、未标记浓度0.1µmol·L-1、DNA模板2µl，Taq酶2U；退火温度为52℃；循环程序为：94℃变性5min后进入PCR循环，94℃30s、52℃30s、72℃1min40sec，扩增40个循环后72℃延伸7min。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。Ⅳ、杂交及结果判读对具有扩增的样品进行杂交检测，在12ul杂交体系中含有，20×SSC终浓度为3×、0.2%SDS、25%甲酰胺、5×Denhardt`s、0.5ul外标和5.26ul的PCR产物，42℃恒温水浴杂交2小时后用2×SSC和0.2%SDS，42℃震荡清洗4min,再用0.2×SSC42℃震荡清洗4min4基因芯片在食品微生物检测中的应用4.1基因芯片技术检测食品常见致病菌基因芯片可以同时固定大量的探针分子，理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，这为平行检测多个菌种或同菌种内多个菌株提供了一条便捷的途径；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。表2列出了近年来应用寡核苷酸芯片对进行微生物检测与鉴定的一些进展。从表2中可以看出,目前用于细菌检测和鉴定的芯片所用探针大多来自于16SrRNA,部分来自于一些功能基因。标记的方法仍然是以PCR过程中进行标记为主。表2应用寡核苷酸芯片进行病原体检测及种类鉴定的部分研究进展检测对象探针标记参考文献大小(mer)来源20种人肠道细菌4016SrDNAPCR扩增样品16SrDNA全长时Taq酶聚合掺入荧光物或地高辛[10]5种较近亲缘关系的杆菌≈2016SrRNA化学方法标记样品16SrRNA的PCR扩增[11]玫瑰杆菌等6种水表面细菌15～2016SrRNA使用indocarbocyanine和生物素标记的引物PCR扩增样品16SrRNA[12]鸡粪便中的弯曲菌弯曲菌27～3516SrRNA与23SrRNA间区域及特有基因荧光引物PCR扩增标记[13]30种菌血症血液中细菌21～3123SrDNA地高辛引物PCR扩增标记[14]大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌等14种细菌13～17gyrBPCR扩增时Taq酶聚合掺入荧光物[15]14种分枝杆菌13～17gyrBT7RNA聚合酶掺入荧光物[16]6种李斯特氏菌17～35Iap,hly,inlB,plcA,plcB及clpE等基因PCR扩增时Taq酶聚合掺入荧光物[17]近来还有的研究者设计了代表肠杆菌科细菌6个菌种常见抗原簇和毒力因子的寡核苷酸芯片，可以同时检测大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的不同菌株[18].在中国，宋亚军等[22〕也利用16SrRNA和23SrRNA基因的寡核苷酸芯片进行了常见病原细菌通用检测尝试，取得了比较满意的结果.此外，一些公司和医疗机构已开发出用于检测结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、绿脓假单胞菌等菌种的基因芯片。最近，博奥生物结合16SrRNA和某些细菌的毒力基因开发了一种食源性致病微生物检测芯片，可同时在种属水平上对E.coliO157:H7、李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、乙型溶血性链球菌、弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、阪崎肠杆菌和志贺菌进行并行检测，4.2基因芯片检测食品微生物的特异性和灵敏度基因芯片检测食品微生物的关键是提高检测的特异性和灵敏度。为了提高基因芯片检测的灵敏度，一方面应在核酸提取前尽量除去基质的污染，采用荧光素对引物末端修饰会比在PCR过程中掺入荧光素的方法产生更低的杂交背景，在靶核酸分子与芯片杂交前通过纯化