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第三章植物组织培养技术---灭菌方法、无菌操作技术内容：灭菌无菌操作愈伤组织的分化与再分化、脱分化形态发生教学目的要求1．掌握外植体的选择条件与消毒方法；2．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境条件；3．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织培养的基础技术。4．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作步骤；本节教学重点、难点：重点：无菌操作技术；组培苗的培养难点：无菌操作技术第一节外植体的选择和消毒一、外植体的选择选取性状优良的种质或特殊的基因型1.选择健壮的植株：健壮、无病虫、发育正常代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功2.选择最适的时期：旺盛生长期注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多，不易消毒而难以培养成功。3.选取适宜的大小：一般0.5-1cm;脱毒0.2-0.3mm材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受伤害胁迫、多形成愈伤组织，甚至难于成活外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同胶皮枫香树（Liquidamnbarstyraciflua“Variegata”）叶片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响外植体部位每个外植体形成不定芽分生组织的数目由培养基上增殖苗中的叶片由温室生长2年的完整植株上的叶片叶柄叶片总数6.78.014.76.750.357.0外植体培养于WPM附加0.1mg/LNAA和2.5mg/LBA的培养基中，实验用外植体数为70二、灭菌与消毒（一）有菌和无菌的范畴有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，它的表面都是有菌的。无菌的范畴：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。菌类：细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点：☆极小，肉眼看不见；☆无处不有，适应能力强；☆繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用的过程。（二）常用的灭菌与消毒方法灭菌方法：物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭菌措施；化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效果。1.湿热灭菌（培养基）高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa开始计时，压力0．1---0．15MPa，20min。注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）镊子、剪子、解剖刀等：→浸入95%的酒精中→酒精灯火焰上灼烧灭菌→冷却后，立即使用。3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）——利用烘箱加热到160-180°C的温度（持续90min）来杀死微生物。注意：1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透；4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。4.过滤灭菌（不耐热的物质）对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素等。滤膜网孔直径：0.45μm以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻。5.紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，要求距照射物以不超过1.2m为宜。(2)熏蒸灭菌使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。常用方法：房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。6.喷雾灭菌（物体表面）70%～75%的酒精l%-2%的来苏儿溶液涂擦、喷雾0.25%—1%的新洁尔灭（桌面、墙面、双手、植物材料表面等）7.植物材料表面用消毒剂灭菌√第一步：1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细洗干净。2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为宜）。3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时（可加入洗衣粉）。第二步：是对材料的表面浸润灭菌。1.准备工作：准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%～75%酒精、消毒液、无菌水、手表等。2.酒精浸润消毒：用70%酒精浸10～30s。70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。3.化学灭菌剂处理消毒剂消毒原理：利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。灭菌剂使用浓度(%)持续时间（min）去除的难易效果次氯酸钙9~105~30易很好次氯酸钠25~30易很好氯化汞0.1~15~8较难最好抗菌素4~50mg/L30~60中较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表第三步.无菌水涮洗——是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。☆灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可；☆升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗6～10次。第二节外植体的接种和培养一、无菌操作：经过必要消毒的操作者在严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)使用消过毒的器皿所进行的操作。（一）无菌操作步骤（实验课）(1)接种室消毒：在接种前用甲醛熏蒸接种室，在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯(2)摆放接种用具：将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等)(3)进入接种室：接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4)手及台面消毒：用70%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后按一定顺序擦拭工作台面；(5)培养材料灭菌：将接种材料预先放入烧杯，置入超净台进行表面消毒。(6)接种用具灭菌：先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。注：接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。（二）接种技术（实验课）1.消毒：将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。2.取材：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。3.接种：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖。具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在培养基上，以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。4.标记：注明接种日期、培养基编号等。第二节外植体的接种和培养二、培养：指把培养材料放在培养室(适宜光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或再生植株的过程。1．培养方法(1)固体培养法——用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。优点：设备简单，操作易行。缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法——用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。优点：能均衡提供养分。缺点：透气性较差。通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给；速度：一般为50-100r／min。滤纸桥方法2．培养步骤(1)初代培养——即接种某种外植体后，最初的几代培养。目的：获得无菌材料和无性繁殖系。培养基：常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。2．培养步骤(2)继代培养——（扩繁培养）是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。扩繁的方法：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。2．培养步骤（3）生根培养生根培养目的：使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养基：可采用1／2或者1/4MS培养基，降低全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。3、培养过程中常出现的问题及解决方法（第四章植物组织培养中常见问题及解决办法）A.培养外植体的污染B.初代培养外植体的褐变C.继代培养时材料的玻璃化初代4.植物组织培养的环境条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。温度(temperature)一般采用25±2℃。低于15℃℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月季足25-27℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。光照(light)主要表现在光强、光质、以及光照时间方面1．光照强度(lightintensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。2．光质(lightwave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。3．光周期(lightperiod)最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明，一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。湿度(humidity)☆实验室环境的相对湿度：一般要求70%—80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。☆培养容器内的相对湿度：100%相对湿度渗透压(penetratingpressure)1—2个大气压对植物生长有促进作用。培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，影响到渗透压的变化。2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用。5—6个大气压植物生长就会完全停止。6个大气压植物细胞就不能生存。pH值(pHvalue)大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.6-5.8。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的。pH值对琼脂的影响：一般来说当pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。pH值在培养基制作中的变化：高温灭菌会降低pH值(约0.2—0.8个pH值)pH值大小调整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单位，lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。种类最适pH值种类最适pH值杜鹃4.0月季5.8越桔4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆5.5桃7.0番茄5.7不同植物的最适pH值玻璃化5、试管苗移栽驯化第五章组培苗的驯