植物组织培养

第二章植物组织培养第一节植物组织培养原理及应用第二节植物组织培养的基本条件第三节外植体的选择与消毒第四节无菌技术百合蝴蝶兰马铃薯草莓葡萄新疆无花果第一节植物组织培养原理及应用一、植物组织培养定义及特点1、定义指在无菌条件下，将植物体的任何一部分（外植体），如器官、组织、细胞以及原生质体等，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育成完整植物体的过程。由于组织培养是在脱离母体的条件下进行的，所以也称作离体培养。2、植物组织培养的类型愈伤组织培养细胞培养器官培养原生质体培养分生组织培养最为常见的组织培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养茎尖、根尖等愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。3、植物组织培养特点①培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。②生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。二、植物组织培养的基本原理1、植物细胞全能性（Totipotency）①植物细胞全能性：1902年由Haberlandt提出，即植物细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。从一个细胞发育成一个植株基础：细胞内具有该物种发育所需的全部遗传物质。细胞全能性的高低：受精卵生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞细胞分化的实质：基因的选择性表达。②全能性的表达少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质,因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞核,因而没有全能性。目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。离体状态营养物质激素适宜外界条件条件无机营养有机营养生长素细胞分裂素在离体培养的选材上，尽可能选取分生组织的部位。将实验目的与外植体生长发育状态相结合，创造良好的离体条件。合理使用生长调节物质。2、细胞分化（Celldifferentiation）①概念（1）分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，包括细胞分化、组织分化和器官分化。（2）细胞分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离体再生的基础。细胞分化的实质：基因的选择性表达。②植物细胞分化的某些规律和机理（1）细胞分化基本分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。（2）分化与极性（Polarity）关系密切。（3）生理隔离或机械隔离在细胞分化中有促进作用。（4）细胞分裂对细胞分化具有重要作用。（5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，促进长芽。（6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响较大。3、脱分化（Dedifferentiation）①概念：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。（2）激素。在诱导愈伤组织时常加入生长素类，同时配合细胞分裂素的效果可能更好。（3）光照。弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。（4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。（5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（6）植物种类的差异。一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。②影响脱分化的主要因素4、愈伤组织（Callus）培养①愈伤组织生长过程在脱分化的过程中，多形成Callus,其细胞结构无明显极性。•（1）诱导期：细胞准备进行分裂，细胞大小几乎不变，生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。•（2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。•（3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能各异的细胞。②愈伤组织的生长特性（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤组织表面形成一层愈伤组织，Callus的细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。（2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆（非胚性愈伤组织）；高浓度细胞分裂素，则可使其致密（胚性愈伤组织）。（3）生理生化变化：RNA③愈伤组织的继代培养在多数情况下，随着培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降甚至死亡。主要原因：染色体畸变，基因突变，生理因素（代谢产物），细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变，培养基损耗等。④愈伤组织形态发生（1）准备：外层细胞分裂逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成维管化组织和瘤状结构。（2）形态发生方式：不定芽方式和胚状体方式。胚状体的形成又可分为直接发生和间接发生5、再分化（Re-differentiation）①概念：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。（1）细胞水平再分化：细胞壁变厚、假导管细胞的形成，酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。（2）组织水平再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织（Vasculartissue）的分化.（3）器官水平再分化：依起源不同，分器官型（Organ）和器官发生型（Organogenesis）。–器官型：直接由外植体细胞形成器官原基，继而发育成器官；–器官发生型：外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。（4）植株再生：根和茎（包括其变态器官）或芽器官的发生可使植株重建。器官发生再生植株的方式大致有：A先形成芽，芽的基部后产生根；B先形成根，根上再出芽；C愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成维管束把两者结合起来.一些变态茎、叶器官，离体培养易于形成相应的变态器官。②影响细胞再分化因素：从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是：（1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）；（2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。渗透压、酸碱度、湿度、温度、光照、营养条件等。三、植物组织培养的发展简史探索阶段（1902-1929年）奠基阶段（1930-1960年）迅速发展阶段（1960-1980）生产上广泛应用阶段(1980-今）四个阶段1.探索阶段（1902-1929年）Haberlandt：贡献：提出细胞全能性假说小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素首次进行离体细胞培养Knop+蔗糖《关于植物细胞培养实验》我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。在未来，人们可以成功地从营养细胞培养出人工胚。1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株1922年：Kotte和Robbins根培养1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种其它研究1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题。2.奠基阶段（1930-1960年）1934年：White培养番茄根，产生愈伤组织1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功1943年：White植物组织培养手册《AHandbookofPlantTissueCulture》，标志组织培养成为一门新兴学科1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管受精奠定了基础1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用。1952-1953年：美国科学家StewardF.C.用胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹，证实了植物细胞全能性学说。1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一个烟草体细胞，单细胞培养成功。1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素组织培养的奠基人3、迅速发展阶段（1960-1980）1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。花卉的快繁：蝴蝶兰花药培养：中花8号水稻、京花1号小麦。体细胞无性系变异：在植株上发生的体细胞变异，未必都能通过性细胞传递到后代，也未必都能通过枝条等营养器官体现在无性繁殖的后代中。为了筛选那些潜在的有利变异，科学家试图通过在植物体外培养植物细胞，使它们成为大群体的植株，从而将细胞发生的变异表现出来。这些体细胞通过形成愈伤组织然后再生的植株群体，称为体细胞无性系，在该群体中出现的变异称为体细胞无性系变异。体细胞无性系变异主要包括基因突变和染色体的结构变异和数目变异。可发生在体外培养之前，也可发生在体外培养过程之中。通过筛选体细胞无性系变异，曾得到优良的小麦品种和花色改变的菊花等。突变体诱导和筛选：细胞突变体的筛选最早始于1959年，G，Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。迄今为止，不少于15个科、45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的细胞突变体或变异体，有抗病细胞突变体、逆境胁迫抗性突变体、抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体等。4.组织培养在生产上广泛应用阶段（1980年-今）四、植物组织培养的过程1.初代培养芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、不定芽或胚状体的过程。返回2.继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。3.生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。4.驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体植物组织培养过程植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的pH值、适时光照等。再生植株的优点：一、发生数量多二、培养周期短三、结构完整，成苗率高四、遗传背景一致五