第六章 RNA的转录与加工

第六章RNA的转录与加工6.1转录(Transcription)概述6.2RNA聚合酶6.3转录的启始、延伸和终止6.4转录后的加工●基因表达的第一步●以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板●在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下●模板单链DNA的极性方向为3’→5’,而非模板单链DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’→3’.DNA(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向)3’----TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand)template(antisensestrand)若干基本概念●按AU，CG配对的原则，合成RNA分子编码链又称有义链，是指与mRNA序列相同的那条链。非编码链又称反义链，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。●某一基因只以一条单链DNA为模板进行转录（不对称转录）●RNA的转录包括promotion,elongation,termination三过程●从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为转录单位（transcriptionalunit）●原核生物中的转录单位多为polycistroninoperon●转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值真核生物中的转录单位多为monocistron,Nooperon+1-10+10upstreamstartpointdownstream6.1转录概述转录指的以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下通过DNA链上的碱基配对来合成RNA的反应。启动子：与RNA聚合酶特异性结合以起始转录的一段DNA序列。终止子：引起转录终止的一段DNA序列。富含GC对。增强子：调节启动子，增强转录效率的一段DNA序列。6.1.1RNA合成的基本特征①合成RNA的底物是NTP，包括ATP、GTP、CTP和UTP。②在RNA聚合酶的作用下，一个NTP的3'-OH和另一个NTP的5'-P反应，形成磷酸二酯键。③RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定，以双链DNA分子中的一条链为模板，按碱基互补配对原则合成。④RNA合成的方向是5'→3'。⑤在RNA的合成中不需要引物。转录与复制的异同？转录与复制存在三个主要不同点：A．转录中不需要RNA引物、以4种三磷酸核糖核苷（NTP）为底物；B．转录反应一般只用一小段DNA做模板；C．在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。6.1.2转录的基本过程无论是原核细胞还是真核细胞，转录的基本过程都包括：起始、延伸和终止。①起始指的是RNA聚合酶结合到双链DNA上，局部解链，使得底物NTP与模板链的碱基能够配对。随着约9nt(核苷酸)!?的掺入，起始阶段结束。②延伸阶段是底物NTP加到生长的多核苷酸链的3'端，在解螺旋区形成暂时的RNA-DNA杂合分子。聚合酶沿着DNA移动，下游的双螺旋再解开一段，使模板链不断暴露出新的单链部分。随着聚合酶向前移动，合成的RNA从模板DNA上脱开，模板DNA与有意义链配对形成双链。③终止反应包括识别特定的终止位点，碱基不再加到链上，转录复合物停止移动，酶和RNA从模板上释放。6.1.3原核和真核生物基因转录的差别①原核生物只有一种RNA聚合酶，负责转录所有类型的基因，而真核生物有三种以上的RNA聚合酶，负责不同类型基因的转录，在细胞核内的位置也不相同。②转录产物有差别。真核的初始产物很长，包括有内含子序列，加工后成熟的mRNA只占其中的一小部分。而原核生物的初始产物与编码的蛋白成线性关系。③真核生物转录产物要经过加工修饰过程。④原核的mRNA是多顺反子，而大多数真核mRNA是单顺反子。把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA。把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA。多顺反子mRNA是一组相临或相互重叠基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子（operon）。操纵子（operon）:是包含几个基因（可作为一个多顺反子的转录物被转录）及其共同调控元件的原核生物基因座。基因座（geneloci）：是指染色体上一个基因的位置，包括两侧的调控元件。其本义是指任何标记物的位置（包括基因、调控元件、复制起始区、细胞遗传学中的标记）。6.2RNA聚合酶RNA聚合酶的主要功能：识别并结合于DNA上的启动子；使DNA解链或恢复双链；通过阅读启动子序列，确定转录方向和模板链；选择正确的NTP，按5’－3’方向催化合成RNA；识别终止子，停止转录；和转录因子（真核）相互作用，以调节转录速度；在受阻遏的情况下进行自我调整，即借助于辅助因子切割转录产物的3’端，恢复合成RNA。6.2.1原核生物的RNA聚合酶6.2.1.1大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶的组成及各亚基的功能E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶。正常情况下一个大肠杆菌细胞中大约有7000个RNA聚合酶分子。E.coliRNA聚合酶的全酶由5个亚基组成，即α2ββ'σ，分子量为480KD;其中α2ββ'构成核心酶，核心酶与σ因子构成全酶。表6-1E.coliRNA聚合酶的基本性质亚基基因全酶中的数量分子量D部位可能的功能αrpoA240000核心酶结合启动子βrpoB1155000核心酶结合核苷酸β‘rpoC1160000核心酶结合模板σrpoD185000σ因子起始识别因子？？111000核心酶？不同的原核生物，具有基本相同的核心酶，但其σ亚基有所差别，决定了原核基因的选择性表达。σ因子；★重复使用(Reusable)★使全酶识别SextamaBox(-35),与模板链结合★修饰RNApol构型，降低全酶与DNA的非专一性结合力增强全酶与R,Bsite的专一性结合力导致RNA链的延伸缓慢α因子；★促使RNApol与DNA模板链结合★位于前端的α因子使双链解链为单链★位于尾端的α因子使单链重新聚合为双链★核心酶的组建因子α+α→2α+β→+β’β因子；★促进RNApol+NTP→RNAelongation★完成NMP之间的磷酸脂键的连接★与Rho(ρ)因子竞争RNA3’-end★构成HoloEnzyme后，β因子含有两个位点Isite(RifS);Esite(RifR);要求高浓度的ATPorGTP专一性地结合ATPorGTP对NTP非专一性结合β’因子；★强碱性亚基★促使RNA与非模板链（sensestrand）结合★受K酶抑制HoloEnzyme含有五个功能位点★sensestrandDNAbindingpoint(β’)★DNA/RNAhybridsite(β)★D.S.DNAunwindingpoint(α)★D.S.DNArewindingpoint(α)★σfactorpoint原核生物RNApol(Core)的结构与功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrandHoloEnzyme使DNA形成10-17bp的解链区原核生物RNApol(Core)的结构与功能EnzymeMovementRNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)IEIsite(RifS);Esite(RifR);非专一性结合NTP专一性地结合ATPorGTP6.2.1.2大肠杆菌RNA聚合酶的催化活性RNA聚合酶全酶结合到启动子区，在DNA链上形成起始复合物开始转录。当酶沿着模板移动，RNA链延伸。σ因子释放，由核心酶负责RNA链的延伸。核心酶覆盖大约60bp的DNA区域，其中解链部分17bp;生长着的RNA链的底物NTP结合位点之前的一段模板是游离的，在结合位点之后的模板与新生RNA形成杂合链，杂合链长约12bp。RNA合成时，前面已经加到RNA链上的最后一个核苷酸的3'-OH与新核苷酸的5'三磷酸之间相互作用，失去焦磷酸基团，形成磷酸二酯键。新核苷酸能否被接受是由RNA聚合酶来监督的。6.2.2真核生物的RNA聚合酶真核生物中已发现有三种细胞核的RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分子量大致都在50万道尔顿左右。它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。RNA聚合酶Ⅰ合成RNA的活性最显著，它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因。而细胞内绝大部分RNA是rRNA。RNA聚合酶Ⅱ位于核质中，负责核内不匀一RNA（hnRNA）的合成，而hnRNA是mRNA的前体。RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多小的核内sRNA。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异性抑制剂，三种真核生物RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。表6-2真核生物RNA聚合酶的比较种类分布亚基种数合成的RNA类型对α-鹅膏蕈碱敏感性Ⅰ核仁6-13rRNA不敏感Ⅱ核质8-11hnRNA低浓度敏感Ⅲ核质10-15tRNA，5sRNA高浓度敏感真核RNA聚合酶区别于原核RNA聚合酶的最大特点是：原核的酶具有全能性，基本不需要其它蛋白因子参与；而真核的酶需要多种转录因子参与才能显示出起始转录的能力。6.2.3转录过程的选择性抑制①放线菌素D是原核和真核生物中RNA聚合酶的专一抑制剂。②利福平也是一种重要的RNA合成抑制剂，它只抑制原核生物RNA的合成，而不抑制真核生物中RNA的合成作用。③α-鹅膏蕈碱是真核细胞中RNA合成的专一抑制剂。6.3转录的起始、延伸和终止6.3.1原核生物基因启动子的结构原核生物的启动子长约20-200bp不等。不同的启动子存在着保守的共同序列，主要集中在-10和-35两个区域。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤（A或G）。起点前面，即5`末端的序列称为上游，后面即3`末端的序列称为下游。通常起点位置用数字+1表示，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3……SextamaBox;RNApol.recognitionsite(Rsite)TTGACA(SextamaBox)-35siteRNApol.looselybindingsitePribnowBox;TATAAT(pribnowBox)-10siteRNApol.firmlybindingsite(Bsite)⑴Pribnow框（-10序列）（Pribnowbox）在转录开始位点上游-10区域，大致在-4~-13之间有一个典型的6bp序列，大多为TATAAT或稍有变化的形式，称为Pribnow框或-10序列。该共同序列的频度为：T89A89T50A65A65T100目前认为，Pribnow框决定着转录的方向，是RNA聚合酶牢固结合的位点(Bsite)，是启动子的关键部位。⑵-35序列（Sexfamabox）(Rsite)在转录起始位点上游-35区域也有一段保守序列，共同序列是TTGACA，称为-35区。其保守频度为：T85T83G81A61C69A52lac启动子的-10区和-35区：PromoterregionincludingSextamaBox;RNApol.recognitionsite(Rsite)TTGACA(SextamaBox)-35siteRNApol.looselybindingsitePribnowBox;TATAAT(pribnowBox)-10siteRNApol.firmlybindingsite(Bsite)Initiationsite;+1RNAtranscriptionalstartpoint(Isite)A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNAR-35B-10I+1SextamaBoxPribnowBoxInitiation-10区和-35区的最佳间距原核基因最佳启动子的一般结构认为是位于转录起点