大肠杆菌对七种常见抗菌药的敏感性试验

河南农业大学牧医工程学院动物医学专业2010届毕业论文1畜禽大肠杆菌对七种常见抗菌药的敏感性试验董卫超（2010届动医专升本08-2）摘要：为了的了解河南地区的大肠杆菌耐药情况，更好的对大肠杆菌病进行有效防治，近期从河南省内数家养殖场的带病或死亡的猪、鸡、鸭分离、鉴定大肠杆菌17株，采用微量肉汤稀释法测定它们对几种常用抗菌药物的敏感性。结果显示：不同源地的大肠杆菌,对单用氟苯尼考、强力霉素的耐药率高达94.1%~100%；单用克林沙星的抗菌活性最强，仅5.9%的菌株产生耐药；SMM/TMP（5/1）联用对大多数菌株的MIC值几乎都是≥640μg/mL；以上结果表明：在河南地区大量存在着耐药大肠杆菌菌株，而且磺胺类药物与叶酸代谢途径抑制剂联用仍表现出较高的耐药率，而单用克林沙星能收到较好的效果。关键词：药物敏感性实验；最小抑菌浓度；大肠杆菌；耐药性；猪；禽TheAntibioticssusceptibilitytestofseveralcommonlyusedantibioticsagainstAnimalE.coliDONGWei-chao(Class2ofAnimalVeterinary,Graduatedin2010)Abstract:InordertounderstandtheresistanceofE.coliinHenanandtocarryouteffectivepreventionandtreatmentofE.coliillness,recentlyweisolatedandidentifide17strainsofE.colifromseveralfarmsofpigs,chickens,ducksinHenanProvince.Microdilutionwasusedtomeasuretheirsensitivitytoseveralcommonantibiotics.Theresultsshowedthattherateisashighas94.1%to100%whenwesingleuseofflorfenicol,doxycyclineresistancetodifferentsourcesofE.coli.TheantibacterialactivityisstrongestwhenwesingleuseClinafloxacin,thedrugresistanceandthedrugresistanceisjust5.9%.CombinedSMMwithTMP,theMICisalmost≥640μg/mL.TheseresultssuggestthatlotsofresistantE.coliispresencedinHenan.Andhighresistancerateswereshowwhensulfonamidescombinedfolicacidmetabolicpathwayinhibitorscombined.AndclinafloxacinreceivegoodresultsKeywords:Drugsensitivitytest;Minimuminhibitoryconcentration;E.coli;Resistance;Swine;Poultry近期随着畜禽养殖业的快速发展，大肠杆菌病已成为危害养殖业的主要传染病之一。近年来，由于长期大量抗菌药物的滥用，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，尤其是兽医临床已出现多重耐药性、超强耐药的大肠杆菌，即同时对兽医临床常用抗菌药物：如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类和氟喹诺酮类等产生耐药性[1]，导致常规药物的药效降低甚至消失，临床可供选择药物的余地越来越少，大肠杆菌病的防治难度日益增加，给养殖业造成了严重的损失。氟苯尼考（Florfenicol）属动物专用的广谱抗生素，具有广谱、高效、低毒、吸收良好体内分布河南农业大学牧医工程学院动物医学专业2010届毕业论文2广泛和不致再生障碍性贫血等特点。多西环素(Doxycycline)是四环素类药物中毒性小、抗菌活性强和与天然品交叉耐药不明显而被广泛应用。喹诺酮类（quinolones）是指一类具有4-喹诺酮环结构的药物，具有抗菌谱广，杀菌力强，吸收快、体内分布广泛，抗菌作用独特，与其他抗菌药物无交叉耐药性。克林沙星属于第四代喹诺酮类药物，抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广、血浆半衰期较长,有望在临床上广泛用于各种感染[2,3]。阿米卡星（Amikacin）又名丁胺卡那霉素，属半合成的氨基糖苷类抗生素。磺胺类药物是20世纪30年代发现并最早应用于临床的化学治疗药物，曾在细菌感染性疾病的控制方面起到了重要的作用。此类药物具有一个氨苯磺酰胺的基本结构，与细菌生长繁殖所必需的对氨基苯甲酸的化学结构相似，能竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，是细菌不能利用对氨基苯甲酸合成叶酸，进而核酸合成受阻细菌生长繁殖受到抑制。SMM是磺胺类中抗菌活性最强的药物，甲氧苄啶（TMP）是抑制叶酸合成中的二氢叶酸还原酶活性，也是细菌叶酸合成抑制，核酸无法合成，与磺胺类药物伍用，对叶酸代谢的双重阻断作用而起到增强抗菌的协同作用[3]。鉴于各种药物的抗菌机理以及抗菌谱，为了更好的指导临床用药及减少耐药菌株产生，故此，对河南部分地区的畜禽大杆菌进行简单药敏分析。1材料与方法1.1试验时间、地点2010年03月08日~2010年04月03日于河南农业大学牧医工程学院药理试验室。1.2试验材料1.2.1病料本试验所用病料如表所示。表1病料来源Table1Sourcesofthediseases菌株编号脏器日龄分离源地近期用药史1肝脏60新乡风景区某猪厂磺胺类药物2肝脏90中牟县官渡镇某猪厂磺胺类药物、氟苯尼考3肺脏90中牟县官渡镇某猪厂磺胺类药物、氟苯尼考10脾脏20新乡获嘉县某猪厂氟苯尼考、头孢噻呋12肝脏50荥阳广武三关猪厂双黄连+头孢噻呋、氟苯尼考、磺胺类药物14脾脏7郑州西开发区沟赵农大博圣猪厂A.注射磺胺类药物、氟苯尼考B.拌料强力霉素、氨基比林、增效剂19肝脏40郑州某鸭厂氟苯尼考21肝脏250新郑某蛋鸡厂不明22肝脏14开封杞县某鸡厂双黄连；拌料强力霉素、泰乐菌素24肝脏30原阳县某鸡厂强力霉素27淋巴结20新乡获嘉县某猪厂氟苯尼考、头孢噻呋28脾脏60南阳新野某猪厂注射：磺胺类口服：阿司匹林29肝脏60社旗县城郊乡某猪厂青霉素、氨基比林、安乃近、抗病毒药30肝脏25社旗县城郊乡某猪厂青霉素类、磺胺类31肺脏120禹州某猪厂痢菌净、安乃近33肺脏120禹州某猪厂痢菌净、安乃近34肾脏90荥阳茹寨村猪厂庆大霉素、盐酸小檗碱河南农业大学牧医工程学院动物医学专业2010届毕业论文31.2.2培养基（1）血平板培养基郑州博赛生物科技股份有限公司。生产批号：100302-1。（2）麦康凯琼脂（不含结晶紫）(Mac-ConkeyAgar)杭州天和微生物试剂有限公司（原浙江省军区后勤部卫生防疫检验所）。（3）营养肉汤(NutrientBroth)北京双旋微生物培养基制品厂。生产批号：20060829。（4）CRM002大肠杆菌显色培养基(ChromogenicE.coliAgar)广东环凯微生物科技有限公司。生产批号：200706166。1.2.3药品阿米卡星：河南牧翔动物药业有限公司，含量：90%；强力霉素：河南牧翔动物药业有限公司，含量：90%；氟苯尼考：河南牧翔动物药业有限公司，含量：95%；恩诺沙星：河南牧翔动物药业有限公司，含量：94%08.08.01；克林沙星：郑州克尔泰生化科技有限公司含量：90%生产批号：20070601；加替沙星：河南大用实业公司含量：98.5%；SMM含量：河南牧翔动物药业有限公司，90%；乳酸TMP：河南牧翔动物药业有限公司，含量：90%；NaOH1mol/L、无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺。1.2.4仪器DZF-6021型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司，编号：20022535；SHZ-88-1台式水浴恒温振荡器：中国太仓市光明实验分析仪器厂，编号：20022544；LRH-250-Ⅱ微电脑控制生化培养箱：广东省医疗器械厂，编号：20022552；洁净工作台：苏净集团安泰公司制造，编号：20002541；GMSX-汽消毒器：北京市永光明医疗器械厂，编号：B26297；BS224S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司，出厂号：50961815；BCD-39VC型新飞冷藏冷冻箱；移液器（0.5~10μL、20~200μL、100~1000μL）；彩色8ch移液器，生产批号：285738；96孔V型反应板：姜堰市新康医疗器械有限公司。1.3操作程序及方法每次实验开始前，先把所需的实验器材置于洁净工作台上打开紫外线灯照射30min后，方可开始试验。1.3.1培养基的制备血平板培养基:可以直接购买后，放置于4℃冷藏备用。营养肉汤培养基:称取营养肉汤粉适量，按照1L灭菌蒸馏水18g营养肉汤粉的比例，加热溶解后，分装试管，每支试管5mL，121℃高压灭菌15min后放入37℃生化培养箱中保存备用。麦康凯琼脂培养基:称取麦康凯琼脂粉适量，按照1L灭菌蒸馏水51g麦康凯琼脂粉的比例，充分混匀，经121℃高压灭菌15min后冷却至50℃左右，在洁净工作台上倾注于灭菌平皿中约15mL即可，凝固后倒置放入37℃生化培养箱中保存备用。大肠杆菌显色培养基:称取本品适量，按照1L灭菌蒸馏水（或去离子水）18g大肠杆菌显色培养基粉的比例混合，搅拌加热煮沸至完全溶解后，经121℃高压灭菌10min后，在洁净工作台上倾注于灭菌平皿中约15mL即可，凝固后倒置放入37℃生化培养箱中保存备用。1.3.2细菌的分离培养病料采集:病料采集前应准备好采样器械和容器，对死因不明的动物必须排除炭疽后才能解剖采样，并在动物死后六小时内进行。尽可能无菌操作采集带病猪、鸡、鸭的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结等[4]，放入干净的自封袋中，尽量避免其他病原微生物对所采集病料的污染。放入冰箱冷冻保存备用。在采集病料的过程中，要注意个人卫生，注意个人防护，病料采集后对动物尸体无害化处理，被污染场地进行彻底消毒。细菌分离培养：按照有关资料所述的方法[5]，将病料从冰箱中取出，待解冻后到洁净工作台上进行无菌操作，划线时右手执接种环，将环直立于酒精灯外焰烧红，再将接菌环横转，在火焰上转动，来回将柄部下端来回灼烧三次，待冷却后，用接种环在病料的新鲜切面上蘸取一环组织液，用左手掌握血平板培养基，无名指与小拇指在平皿底部，食指在平皿盖上，大拇指及中指将平皿盖掀开一口，右手的接种环用连续划线法先将组织液涂于培养及边缘，成为基准线，从基准线开始向左右两侧划开，并连续向下移动，连续划成若干条曲线[4],在酒精灯旁划线接种后37℃培养24小时。增菌培养：左手持血平板培养基、营养肉汤试管，右手持灭菌接种环在长有细菌菌落的血平板培养基上用接种环挑取单个典型菌落后，拔下棉塞，夹持于右手小拇指与手掌中间，将接种环插入营养肉汤试管中，在试管内壁与液面接触处轻轻涂擦使样品乳化，接种于营养肉汤试管中进行增菌培养，河南农业大学牧医工程学院动物医学专业2010届毕业论文4接种完毕后，塞上棉塞竖立放置，37℃培养24小时（菌液1）[6]。菌种鉴定：用接菌环挑取一环试管中的菌液1，在麦康凯琼脂平板上进行划线接种，37℃培养24小时，观察细菌菌落大小、颜色等生长性状。再用接菌环挑取桃红色菌落，再次接种至营养肉汤培养基中37℃增菌培养24小时（菌液2）。然后再用接菌环钩取一环菌液2，在大肠杆菌显色培养基上划线接种后，37℃增菌培养24小时，进一步确认是否为大肠杆菌。1.3.3药液配制药物称取：用电子天平称取：阿米卡星0.0071g，强力霉素0.0071g，氟苯尼考0.0067g，恩诺沙星0.0068g，克林沙星0.0071g，加替沙星0.0065g，SMM0.0142g，乳酸TMP0.0206g。药液配制：将称量好的药品用无菌蒸馏水配制成浓度为1280μg/mL的药液，置4℃