大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

1大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3（1.河北北方学院，河北张家口，075131；2.中国人民解放军军需大学，吉林长春；130062；3.军事兽医研究所，吉林长春；130062）摘要：目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词：大肠杆菌多重耐药外输泵acrAmarA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（effluxpump）的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发现外输泵最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星，对照品，中国兽医药品监察所出品。染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。载体与质粒：克隆载体为pGEM－T，Promega公司产品。酶与试剂：T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂；DNA片段凝胶回收试剂盒（AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0），TaKaRa公司产品；国家自然基金资助项目，No30270999作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者E-mail：[e-mail]..cn2分子量标准参照物：DNAMarkerDL2,000、λ－HindⅢdigestDNAMarker，均为TaKaRa公司产品。引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5´－ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGCCT－3´；下游引物（PACR－R）5´－TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG－3´，marA的上游引物（PMAR－F）序列为5´－ATGACGATGTCCAGACGCAATAC－3´，下游引物（PMAR－R）5´－CTAGCTGTTGTAATGATTTAATGG－3´。上海博亚生物技术有限公司合成。仪器：生物显微镜，OLYMPUS产品；PCR扩增仪，TC－25/H型，杭州DAHETHERMO－MAGNETICSCO.LTD产品；电泳仪，DYY－6B型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器，HZQ－C，哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL－16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。1.2.方法1.2.1菌株鉴定对购进的菌株作生化和形态鉴定，以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养，再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基质试验、M.R试验、V—P试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴定确认为ATCC25922的菌株作后续实验之用。1.2.2MIC测定按照NCCLS（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards）规定的方法配制包括诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药的标准溶液；用2倍连续稀释法配制各种含抗菌药的营养肉汤培养基，抗菌药的首选浓度范围为0.125～4.0μg/ml培养基（据细菌生长情况再作升或降的调整）。在1ml培养基中接种100μl菌液（约为105CFU）；37oC培养24h，确定MIC。1.2.3诱导分别在三种含1/2×MIC诱导剂的麦康凯培养基接种适量培养物（约105CFU），37oC培养24h，挑选生长良好的菌落，接种于1×MIC诱导剂的培养基37oC培养24h，以此类推，逐渐提高培养基中诱导剂的浓度直到诱导前MIC的128倍（据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度可在1～2倍于原浓度的范围适当调整，也可当细菌生长不良时在同一个浓度重复传代培养）。1.2.4耐药谱的确定上一步最后获得的诱导剂浓度达到128×MIC的耐药株，作4次无诱导剂传代培养后，再分别测定三个诱导株对所有受试抗菌药的MIC，以确定三个诱导株的多重耐药谱。1.2.5受试菌株acrA、marA基因序列的检测据上一步耐药谱检测结果，氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的耐药谱相近，而四环素诱导株的耐药谱与之差异较大，故选择四环素诱导株（名为SEMR）、环丙沙星诱导株（名为SEICI）和质控株（ATCC25922）作acrA、marA基因序列的检测。1.2.5.1目的基因（acrA、marA）的获取1.2.5.1.1DNA提取：按卢圣栋等[4]的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因组DNA。1.2.5.1.2acrA、marA基因的PCR扩增：以大肠杆菌染色体DNA为模板，用引物PACR－F和PACR－R扩增acrA（全长1194bp），用PMAR－F和PMAR－R扩增marA（全长390bp）。取5µlPCR产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳观察PCR结果。1.2.5.1.3PCR产物的回收：用DNA片段凝胶回收试剂盒回收acrA和marA基因的PCR产物，方法按试剂盒使说明书进行。31.2.5.2acrA、marA基因的克隆1.2.5.2.1目的基因片段与载体的连接：将回收的PCR产物连接到pGEM－T载体上。反应体系为：2×RapidLigationBuffer，5µl；PCR产物（2ng/µl），3µl；pGEM－Tvector（50ng/µl），1µl；T4DNALigase，1µl。16℃连接过夜。1.2.5.2.2感受态菌的制备：CaCl2法制备DH5α感受态细胞[5]。1.2.5.2.3重组质粒的转化：参照《分子克隆指南》[5]进行。1.2.5.2.4阳性克隆的筛选：利用α互补法（蓝/白菌落筛选法）进行阳性克隆的初步筛选[5]。1.2.5.3重组质粒的鉴定1.2.5.3.1提取质粒：碱裂解法[5]提取质粒，作0.7％琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察并拍照。1.2.5.3.2重组质粒的酶切鉴定：用NcoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T质粒。将经过电泳筛选出的疑似阳性克隆质粒进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切反应，同时做阴性克隆质粒的酶切对照。酶切反应体系为：克隆质粒，5µl；10×HBuffer，1µl；0.1%BSA，2µl；NcoⅠ，1µl；NotⅠ1µl；ddH2O，10µl。37℃恒温水浴2~4h。0.7%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下观察电泳结果并拍照。1.2.5.3.3重组质粒的PCR扩增鉴定：利用PCR反应，对经过上述鉴定的疑似阳性质粒再作PCR扩增鉴定。用引物PACR－F和PACR－R扩增鉴定acrA－pGEM－T质粒；用PMAR－F和PMAR－R扩增鉴定marA－pGEM－T质粒。取5µlPCR扩增产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。1.2.5.4重组质粒的核苷酸序列测定与分析对经上述鉴定后均符合要求的阳性克隆质粒进行序列测定（上海博亚生物技术有限公司完成），用DNAsis软件分析测序结果。2结果2.1受试药物的MIC包括三种诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药对于质控株的MIC见表1。2.2诱导株的耐药性变化四环素、环丙沙星和氯霉素三个诱导株的MIC变化详见表2。从表中可见，在四环素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外，青霉素钾、头孢噻肟、四环素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢西丁的MIC提高幅度都有达到或超过4倍（经统计处理，MIC变化值≥4×MIC为具有显著性意义）；在环丙沙星诱导株，只有头孢噻肟MIC提高倍数达到或超过了4，而其它受试抗菌药的MIC变化都没有显著性意义；氯霉素诱导株与环丙沙星诱导株相似，只有头孢噻肟的MIC提高具有显著性意义，而其他药物没有显著意义。2.3acrA、marA基因检测结果2.3.1SEMR、SEICI和ATCC25922基因组DNA的提取结果从ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色体DNA作0.7%的琼脂糖凝胶电泳，观察到一条特异带，大于23kb。见图1。2.3.2SEMR、SEICI、ATCC25922acrA、marA基因的PCR扩增结果acrA、marA的PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarkerDL2,000为对照，结果在约1194bp和390bp处分别出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。见图2、图3。4表1受试药物的MIC（ug/ml）Table1MICofantibacterialagents（ug/ml）抗菌药MIC抗菌药MIC抗菌药MICantibacterialagentsantibacterialagentsantibacterialagents青霉素钾BenzylpenicillinK64氧氟沙星Ofloxacin0.5甲砜霉素Clinfenicol16头孢噻肟Antibacterial0.25诺氟沙星Norfloxacin0.25阿米卡星Amikacin32四环素Tetracycline4头孢西丁Cefoxitin0.5环丙沙星Ciprofloxacin0.25土霉素Oxytetracycline8链霉素Streptomycin64妥布霉素Tobramycin8氯霉素Chloramphenicol16小诺霉素Micronomicin1利福平Rifampicin32表2诱导菌株的MIC变化Table2ChangeforMICofinducedstrains受试药物antibacterialagents诱导后MIC提高倍数IncreasingpowerofMICafterinduction四环素诱导株环丙沙星诱导株氯霉素诱导株strainsofTetracyclinestrainsofCiprofloxacintrainsofChloramphenicol青霉素钾BenzylpenicillinK802头孢噻肟Antibacterial25688四环素Tetracycline12820土霉素Oxytetracycline162