网织红细胞检测进展及其临床应用

网织红细胞检测进展及其临床应用概述网织红细胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内尚残留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青B、煌焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可见蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。概述红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越多，表示细胞越幼稚。ICSH（国际血液学标准委员会）将Ret分为4型：Ⅰ型（丝球型）、Ⅱ型（花冠型或网型）、Ⅲ型（破网型）、Ⅳ型（颗粒型）。正常生理状态下，Ⅰ型只存在于骨髓，Ⅱ型在外周血也很难见到，Ⅲ型仅有少量释放到外周血，因此外周血网织红细胞计数时以Ⅳ型为主。网织红细胞分型ICSH将网织红细胞分类四型：IRF（未成熟网织红细胞比例）=HFR+MFR•I型（丝球型）：红细胞几乎被网织物充满，此型亦仅见于正常骨髓中。•II型（网型）：位于红细胞中央线团样结构，开始松散、此型大量存在于骨髓中。•Ⅲ型（破网型）：网织结构稀小，呈不规律枝点状排列，外周血中可见少量。•IV型（颗粒型）：胞浆中嗜碱物质很少，呈分散的细颗粒、短丝状，正常外周血中的网织细胞大多见于此型。ⅠⅡⅢⅣHFRMFRLFR网织红细胞检测进展1.手工法2.血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪1.手工法手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低；试管法容易掌握，重复性较好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被列为手工法Ret计数的参考方法。按卫生部《全国临床检验操作规程》第2版，采用试管法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片，选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份标本油镜下，Ret6%，计数红细胞1000个；3%～5%计数红细胞2000个；1%～2%应计数红细胞4000个；小于1%计数红细胞10000个。•网织细胞的活体染色:ⅰ染色时间:2~8minⅱ比例:用2%的煌焦油兰染色以滴数计1:5时,网织细胞数开始减少,1:2为最佳.ⅲ涂片部位:中部为佳.ⅳ玻片干燥程度:立即干燥者最佳.•普通光学显微镜法:计数1000个RBC中的Ret,以百分数表示.•传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较多。近年来，国内开始使用国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的Miller窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高(卫生部临检中心建议，CV控制在15%之内)。Miller窥盘法是将一种光学圆片状Miller窥盘安放在显微镜目镜中，窥盘中有面积比例为1：9的2个正方形计数方格，只需计数1／9小方格内的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量计算方法1.Miller窥盘法：网织红细胞（Retic）百分率(%)=（大方格内Retic总数）/（小方格内RBC总数×9）×100%2.直接计数法：网织红细胞（Retic）百分率(%)=多个视野内Retic总数/多个视野内RBC总数×100%卫生部临床检验中心控制Ret计数CV≤15%需镜检的RBC数目Ret(%)计数Miller窥盘小方格RBC相当于缩视野法计数RBC数目1-244440003-5222200061111000手工法网织红细胞活体染色染料评价染料评价新亚甲蓝WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定，Hb几乎不着色煌焦油蓝溶解度低，染料沉渣易附着红细胞表面，影响辨认；易受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰中性红染液浓度低、背景清晰、网织颗粒与红细胞对比鲜明；不受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰参考值成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%）新生儿：0.02-0.06（2%-6%）儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%）成人绝对值（24-84）109/L2.血细胞分析仪法虽然仪器法Ret计数有诸多优点，而且精密度明显优于手工法，但也存在一些不足：第一，所有仪器分析的基本原理都是检测Ret内RNA的存在量来决定其百分率和绝对值，当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异常增加时，可导致Ret计数结果的假性增加；第二，冷凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能使红细胞产生自身荧光；第三，自动化分析仪结果的准确性除了依赖于仪器本身的良好性能外，还应有良好的质控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成本高、价格贵，基层医疗单位投入较为困难。•说明:虽然大多数仪器都利用了流式细胞技术,但它们在应用的染料,检测技术方面还是有各自的特点.通常荧光的强度,光吸收量,和光散射量与网织细胞的RNA含量成正比.仪器型号处理染色检测技术BayerADVIA120活体Oxazine750光吸收BayerH*3活体Oxazine750光吸收AbbottCellDynCD3200活体新亚甲蓝光散射AbbottCellDynCD3500活体新亚甲蓝光散射AbbottCellDynCD3700活体新亚甲蓝光散射AbbottCellDynCD4000荧光CD4K530荧光法BectonDickisonReticCountFACSCount荧光噻唑橙荧光法BeckmanCoulterSTKS活体新亚甲蓝VCSBeckmanCoulterGENS活体新亚甲蓝VCSSysmexXE2100荧光聚次甲基荧光染料光散射ABXPentra120Retic荧光噻唑橙光散射3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪流式细胞仪(flowcytometry，FCM)是一种多用途的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等这些特殊的荧光染料与Ret中的RNA结合，当FCM发出的激光照射于细胞上时，根据细胞能否发射出特定颜色的荧光，通过单参数定量测定RNA，从而精确测定Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出的荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对Ret成熟程度进行分群，将其划分为低荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)。3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪FCM测定精密度明显高于手工法3～6倍，可在数秒中检测20000个以上的红细胞，如Ret在1.7％～6.6%，其平均CV值在4.3%。不足之处，流式细胞仪计数Ret受HOWELL－Jolly小体、疟原虫和血小板等干扰。6项网织红系参数网织红细胞百分比RET%网织红细胞数RET#未成熟网织红细胞比例IRF低荧光强度网织红细胞比率LFR中荧光强度网织红细胞比率MFR高荧光强度网织红细胞比率HFRRBCLFRMFRWBCPLT-OHFRRET%=RET#/RBC-ORET#=RBC-O*RET%IRF=MFR+HFRLFR=LFR#/RET#-OMFR=MFR#/RET#-OHFR=HFR#/RET#-ORET%--网织红细胞占全部红细胞的比率RET#--网织红细胞绝对数目IRF--未成熟网织红细胞比例=HFR+MFRLFR—IV型网织红细胞MFR—III型网织红细胞HFR—I型和II型网织红细胞小结网织红细胞计数方法学评价检测方法评价普通显微镜法简便、成本低，可直观细胞形态；影响因素多，重复性差玻片法水分易蒸发，染色时间短，结果偏低试管法易掌握，重复性较好，易复查Miller窥盘计数法规范计算区域，减少了实验误差，ICSH推荐方法仪器法检测细胞多，精密度高，与手工法相关性好，易标准化。仪器贵；受H-J小体、有核红细胞、血小板等干扰临床意义•1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可做为急性再障的辅助诊断指标。失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明显高于正常。营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升高或降低。（2）评价疗效网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高(10%左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血红蛋白开始升高。骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。（3）放、化疗监测•机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。网织红生成指数（Reticulocyteproductionindex,RPI）•RPI=病人网织红细胞（%）/2*病人HCT/正常人HCT（男0.45，女0.40）•临床应用：•＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；网织红细胞检测的临床应用Ret计数及其各种参数(IRF、RMI、MRV、RPI等)在贫血的诊治、骨髓移植、肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面具有重要参考价值。1．网织红细胞计数的应用贫血的恢复是通过骨髓释放红细胞生成素(EPO)完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能对贫血的正常反应。失血性贫血时患者Ret各项指标会显著增高，失血5～10d内Ret可达高峰，出血停止后2周可恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血是否停止；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时也可见患者Ret轻度增加。Ret降低主要和造血功能减低有关，典型病例为原发性再生障碍性贫血、溶血性再生障碍性危象；此外还有急性白血病、继发性再生障碍性贫血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等。2．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI代表网织红细胞的生成相当于正常人的多少倍。不同生理、病理情况下，Ret从骨髓释放人外周血所需时间不同，故Ret计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造血功能，还应考虑Ret生存期限。通常Ret生存期限约为2d，若未成熟网织红细胞提前释放入血，Ret生存期限将延长，为了纠正网织红细胞提前释放引起的偏差，用RPI来反映Ret生成速率。2．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI=RET%×被测HCT/正常人HCT×1/RET成熟天数。释放入外周血的网织红细胞越趋于幼稚，其成熟时间越长。由于网织红细胞体积大于成熟红细胞，大量网织红细胞的提前释放在某种程度上影响血细胞比容的测定结果。经观察，网织红细胞成熟时间与Hct存在下列关系HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.23﹤0.15Ret成熟时间(d)11.52.02.53.02．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI在估计红细胞生成有效性和贫血起因的分类方法中起到重要作用。Kinetic等应用RPI较为准确地表达出Ret的成熟状态，从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均RPI为1，当RPI≥3时表示红细胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而RPI≤2时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；对于EPO缺乏、无效造血等情况时，RPI多在2～3之间，Kinetic法则还无法确定。3．网织红细胞成熟度(IRF)的应用IRF为不成熟的Ret与总Ret的比值，健康者平均值为0.22，参考范围0.1～0.38，IRF越大表示不成熟的Ret的数量越多。这种幼稚Ret水平的改变一般比患者HGB、血小板、白细胞和临床症状的变化出现更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化疗中是与粒细胞反应一致的指标和骨髓移植后恢复的第一信号。IRF与Ret#和RPI呈一弱的、显著的正相关：IRF增加(≥0.23)，一般伴有Ret#增加，提示患者对于贫血有足够的红系反应；若IRF＜0.23，且RPI≤2，则说明红系造血活性下降，则以慢性肾功能不全居多；Ret#正常或略低，RPI≤2，但IRF≥0.23，见于急性感染、镰状细胞性贫血危象、妊娠和MDS等状况。IRF是评价贫血红系增生活性的一项新的有用的指标，IRF结合Re