培养基、缓冲液、稀释液、淋洗液和试剂的验证

培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液和试剂的验证教学目标：1、掌握培养基概念与分类、2、熟知培养基的制备、融化程序的确认及注意事项与培养基储存3、知道培养基、缓冲液、稀释剂、淋洗液的质量控制和染色液与各种生化反应试液的验证。4、了解文件管理与标签、有效期的确教学重点与难点:1、培养基的制备、融化程序的确认2、培养基、缓冲液、稀释剂、淋洗液的质量控制和验证。药品的无菌检查及药品的微生物限度检查、抗生素的微生物效价测定等的微生物实验操作离不开培养基。而微生物生长、分离、鉴别、保存也要使用到培养基，此外在实验中要制备保护微生物菌种的缓冲液、稀释样品的稀釋液或淋洗器具及滤膜用的淋洗液、以及在菌种鉴定中用于生化反应的各种指示剂等一系列的试剂。这些培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液、及指示剂等的配制是开展微生物实验的重要基础工作。如果培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液、试剂配制有误，那么由此而得到的实验结果都是不可靠的。因此，有关培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液和试剂的配制也是GMP认证中检查、关注的重要领城内容。•一、培养基的概念与分类划分•二、培养基的制备、融化程序的确认及注意事项•三、培养基的储存•四、质量控制•五、染色液与各种生化反应试液的验证•六、缓冲液、稀释液、冲洗液•七、文件管理、标签•八、有效期的确认•九、培养基灵敏度的验证试验实例•小结及作业一、培养基的概念与分类划分培养基是指人们根据微生物生长繁殖所需的各类营养物质，按一定的浓度由人工方法混合配合而成的用于培育微生物生长的一类营养基质而称之。按使用时的不同物理状态，培养基可分为：液体培养基、半固体培养基、固体培养基3种。根据不同用途（使用目的），培养基又可分为：基础培养基、富集培养基（营养或增值培养基）、选择性培养基、鉴别培养基、厌氧培养基5类。按其营养成分和浓度是否已知可分为：合成培养基(营养成分和浓度已知)、天然培养基(营养成分和浓度未知)2种。返回二、培养基的制备、融化程序的确认及注意事项（一）培养基的制备微生物实验室所用培养基可按药典规定检查方法中所列的培养基配方配制，也可使用复合型的干燥培养基，或是使用已配制且分装好的成品培养基。中国药品生物制品所监制的产品和广东省环凯微生物科技有限公司生产的各类干燥培养基产品•配制培养基、缓冲液、试剂等时，称量要迅速以免吸潮而影响称量的准确性，同时为避免增加培养基等中的金属离子及其他微量化学元素而影响微生物的生长、鉴别、所用器具、容器应为洁净玻璃制品，所用溶解用水应为纯水或蒸馏水。加热溶解时不断搅拌促进培养基充分溶解，采用直火加热时易使培养基结底碳化而影响营养度和澄明度，可用沸水浴或隔套蒸锅通过蒸汽加热。然后调节pH值，按规定的要求分装•制备好的培养基、缓冲液等应及时抽取适量用于检查pH值、无菌性、灵敏度等质量是否符合规定。微生物检验用培养基、缓冲液及试剂的配制应有原始记录供追溯检查。所有相关信息包括：名称、处方原材料、称量数、稀释溶解量、灭菌条件、灭菌程序参数，制备日期、制备人签名、质量检查结果等，都必须在原始记录或工作日志上反映出来。(二)培养基融化程序的确认•装于试管瓶内的成品固体培养基，在使用前需将其融化。这一融化过程也同样需要确认，以保证培养基的营养成分不会因过度加热而受影响。•一般培养基应只能进行1次蒸汽灭菌处理，否则，重复高温加热会破坏培养基的营养成分。因此，不宜使用蒸汽灭菌柜融化琼脂培养基，宜选用沸水浴或微波炉融化培养基。因沸水浴的温度始终控制在100℃以内，相当安全，但对装量较大的培养基要使融化均匀充分，则加热的时间较长，微波炉融化培养基具有快速的优点。(三)培养基制备应注意事项•1.常用玻璃仪器的准备制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，凉干后备用。⑴平皿用纸或布包好，或装在金属盒内，于121℃高压蒸汽菌20min后烘干，备用。(2)试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，再用布或报纸包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用。(3)吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽内的气体污染），然后用纸包后或装入金属吸管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干,备用。其他玻璃器皿均应按上法处理，也应装金属筒内160℃干热灭菌2h后,备用。2.培养基的制备及储存•(1)溶化一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内。加入蒸馏水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。•在使用干燥培养基时，先将蒸馏水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10～15min，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。(2)校正酸碱度（调节pH值）培养基必须有适当的pH。因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH值的标准温度为25±2℃。调节pH值可用无菌的1mol/L氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/L盐酸溶液。•对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH值均进行测定，并记下每次pH值的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH值的调节。干燥培养基一般已校正过pH，用时也必须再验正。测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤,使培养基澄清。（3）培养基的分装大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认。每次使用前后，均要对分配器的管道系统进行冲洗，在分装无菌培养基前，则要采用无菌硅胶管。•固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。•平皿：倾注平皿，应在无菌室中放置3～4h，如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～60min。让水蒸汽会自然蒸发。•斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，如沾有培养基应用布抹去，以避免污染。•高层斜面:制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。•分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理。液体、半固体培养基一般在高压灭前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加其它成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。(4)培养基的灭菌•培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min，但容器和装量较大时，应延长至20min。含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min。含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80～100℃、30min，连续3d，间歇灭菌。血清或组织液，采用低热56～58℃水浴1h，连续5～6d灭菌，一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等，可用细菌过滤器，过滤除菌。高压灭菌应严格按照操作规程执行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全部杀灭微生物。以上的灭菌时间和温度要经过验证确认，如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好。返回三、培养基的储存•一般来说，未开封的脱水培养基应避光储存于25℃以下阴凉干燥处，开过封的脱水培养基应盖紧瓶盖注意密封储存。已配制好的培养基、缓冲液一般可储存于2～25℃阴凉干燥处，有条件置冰箱冷藏储存更好，否则必须在2d内使用完毕。USP中有明确规定：置2～25℃阴凉干燥处如果培养基分装并储存于非密闭性容器内（如试管、三角烧瓶），则其使用期限为1个月，但该培养基的灵敏度试验和其他的相关质量检查务必在距使用时的前2周内完成；如果培养基储存于密闭性容器（如螺旋盖瓶）内，则其使用期限为1年，但该培养基的灵敏度试验和其他的相关质量检查须在距使用前3个月内完成：如果实验室购买的成品型培养基储存于密闭容器内，实验室可抽取部分代表性样品进行无菌检查试验和灵敏度试验。并根据自己的贮存条件来制定合理的培养基贮存期，对培养基的存储环境条件进行监控和记录，并且要对相应的贮存期和贮存条件进行确认。表5－1：无菌物品的存贮条件类型存放条件无菌保效期(年、月、d)输液瓶密封装培养基2～8℃1年输液瓶密封装淋洗液、缓冲液室温2年螺旋盖瓶装培养基2～8℃3个月螺旋盖瓶装淋洗液、缓冲液室温3个月试管装无菌培养基（固/液）2～8℃14d试管装有其他的无菌试剂室温14d平皿琼脂培养基25-35℃下培养3天后，存于2～8℃14d取样用螺旋盖瓶室温7d过滤器等无菌操作用物品室温，洁净室内或层流台内7d表5-2:培养基2~8℃条件保存期限培养基种类保存条件保存时间平板培养基不袋装袋装2周6~8周试管培养基（棉塞）不袋装袋装2~4周8~10周试管培养基（软木塞或蜡封）不袋装袋装8周16~18周有效期已过的培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液和试剂必须立即丢弃，不得再用于检测中。实验室应建立有简易的库存控制系统，有专人保管和建立台帐，包括品名、规格、批号、数量、有效期、进货日期、使用日期和数量、以及领用人等信息，以随时掌握有关信息。返回四、质量控制(一)外观检查在配制后使用前，要认真仔细检查培养基、缓冲液、稀釋液、淋洗液等的颜色和澄明度。培养基经高温灭菌后，颜色往往会稍微加深，但如果颜色过深，则表明灭菌温度过高或时间过长引起营养成分炭化。有些培养基中含有琼脂、卵磷脂等难溶组分，如果配制时搅拌不充分，则会导致培养基浑浊，甚至会有颗粒样物质漂浮于培养基中。(二)pH值检查灭菌时温度过高或时间过长会使培养基中营养成分分解而使pH值升高或降低，pH值对微生物生长非常关键。(三)培养基的无菌性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的无菌性检查方法是：抽取一定比例样品（每批培养基随机取不少于5支（瓶），并将其置于按既定用途所确定的条件下（温度、厌氧、需氧环境）培养14d；观察是否浑浊及有菌生长。培养基的无菌性检查亦可与供试品的无菌检查同时进行。其它检查所用的培养基也可按此要求抽样后经适温培养一定时间检查有否微生物生产便可。（四）培养基的灵敏度检查（促菌生长性）培养基灵敏度检查（促菌生长性）的意义是证实在规定的实验条件下，培养基能支持微生物的生长，那么检品中可能存在的微生物就能在该培养基内或培养基表面生长或出现浑浊或形成菌落，从而检测结果的真实性和防止出现假阴性。为确保培养基灵敏度（促菌生长性）的可靠，灵敏度试验应做双份检查，并且要使用低菌接种量（菌接种量一定要控制在100个CFU／ml以内）尤其重要。1.《中国药典》(2005年版)无菌检查用培养基的灵敏度检查方法《中国药典》要求对所购的每个批号的脱水培养基均进行灵敏度检查。•检查的菌种有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)10104〕；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC(B)63501〕；生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)〔CMCC(B)64941〕；白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕；黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕。(1)菌液制备•接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h；生孢梭菌的新鲜培养物接种到硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24h；白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h；黑曲霉的新鲜培养物[方法是将黑曲霉菌接种至真菌琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7d，使大量的孢子产生。加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，用玻棒将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝装置（如薄的无菌棉花或纱布的无