奶牛乳房炎大肠杆菌整合子与耐药表型的相关性研究

书书书畜牧兽医学报!!#!$%&!#$&$’(!&$(!#$%&#&’()$’($&#*++#&,)($-()($奶牛乳房炎大肠杆菌整合子与耐药表型的相关性研究王桂琴!!!吴聪明!!曹兴元!!沈建忠!!#中国农业大学动物医学院!北京!$$$%&%#宁夏大学农学院!银川’($$!#摘!要!为研究自乳房炎奶牛分离的大肠杆菌整合子携带情况与其耐药表型之间的相关性!在获得菌株对$种抗菌药物耐药谱的基础上!设计!&&#类整合子简并引物扩增菌株的整合酶基因!并结合内切酶限制性片段长度多态性分析!调查菌株携带的各类整合子!然后进一步扩增菌株整合子的基因盒插入区!测序分析其携带的基因盒’结果发现!)$株自奶牛乳房炎病例分离的大肠杆菌中有*’株检出!类整合子检出率&+,(-#!未检出类和#类整合子’!类整合子阳性菌中*!株扩增出*种不同大小的基因盒插入区片段!插入基因盒主要是二氢叶酸还原酶基因./’#和氨基糖苷类抗生素耐药基因$$.!#!最主要的基因盒排列为./’!!’0$$.!(’分析表明!!类整合子集中分布在耐受’种以上抗菌药物的菌株中!与菌株的多重耐药性高度相关!而菌株!类整合子携带的耐药基因盒与其耐药谱缺乏对应关系’关键词!整合子%基因盒%大肠杆菌%耐药性中图分类号!.)(),*(,!.)(,+!!!!!文献标识码!/!!!!文章编号!$*++0+%+&#$$’$!0!*&(0$+收稿日期!$$’0$0$)基金项目!国家(十一五)科技支撑计划项目$$+1/2$/$*#作者简介!王桂琴!%’$0#!女!河北清苑人!副教授!博士生!主要从事兽医药理与毒理学研究!304567$89:;$!+#=4通讯作者!沈建忠!%+*0#!教授!主要从事兽医药理与毒理学研究!?@7$$!$0+’*)$*!304567$ABC$=5D#@ED#=8)*++,-./0*12,/3,,141/0506+*20.-7,808/.16,.19:1/,;+*18*!#$%&’#$’(#)*’=/+.018:8*-./,9+*5*?01,@.8/0/08@0-A=.5B-,8F/GHHD6068!!!FIJ8;0468;!!J/KL68;0MD58!!.N3GO6580CP8;!!12&3$’#4&)#+/5,$’4$+6+789:+;(+6+78!+66&7&+/%&#&’()$’8=&.(()&!,()$!7’(6#’$6?)(@&’A(#8!B&(C()7!$$$%&!,()$%1+66&7&+/!7’(6#’&!D()7;($?)(@&’A(#8!E(),$)’($$!!,()$#428/+.6/$?P6AAQDEM68R@AQ6;5Q@EQP@=SS@75Q68T@Q:@@858Q646=ST657S@A6AQ58=@UFA,&’(,($+6(AQS568A6A75Q@EUS4TR68@45AQ6Q6A467VA54W7@A58EQP@68Q@;S8A#/UQ@S5=D6S@4@8QUQP@58Q646=ST657S@A6AQ58=@W5QQ@S8A!68Q@;S5A@;@8@:5A54W76U6@ETMXJYDA68;E@;@8@S5Q@WS64@SA#?P@68Q@;S8A:@S@=8U6S4@ETMS@AQS6=Q68US5;4@8Q7@8;QPW7M4SWP6A4YZ[X#5857MA6AUWA6Q6R@XJYWSED=QA!QP@868Q@;S5Q@E;@8@=5AA@QQ@A:@S@@95468@E#?P@68=6E@8=@U=75AA!68Q@;S868QP@)$AQS568AUF1+6(:5A&+,(-*’*)$##/7768Q@;S8A:@S@S@R@57@E5A=75AA!68Q@;S8#G@6QP@S=75AA8S=75AA#68Q@;S8:5AE@Q@=Q@E#?P6SQM08@AQS568A=5S0S6@EQP@68Q@;S5Q@E;@8@=5AAQQ@A:@S@E@Q@=Q@E68QP6SQM0A@R@868Q@;S80WA6Q6R@ASQ568A#?P@=75AA!68Q@;S8:5AWS@R57@8Q68AQS568A:P6=P:@S@S@A6AQ58QQ4S@QP58A@R@858Q646=ST657A#J75AA!68Q@;S8AP5STS@E./’58E$$.!;@8@=5AA@QQ@A=8U@S@ES@A6AQ58=@QQS64@QPWS6458EAQS@W0Q4M=68!S@AW@=Q6R@7M#?P@SE@SU456868A@SQ@E;@8@=5AA@QQ@A:5A./’!!’0$$.!(#?P@S@:5A5;E=SS@75Q68T@Q:@@868Q@;S8=5SS6@E58EQP@4D7Q60S@A6AQ58=@!TDQQP@58Q646=ST657S@A6AQ058=@W5QQ@S8AE6E8Q=8A6AQ:6QPQP@;@8@=5AA@QQ@A#C,D3*+98$68Q@;S8%;@8@=5AA@QQ@%FA,&’(,($+6(%58Q646=ST657S@A6AQ58=@畜!牧!兽!医!学!报*)卷!!!整合子是细菌的\G/片段!它可捕获外源性基因!并使之转变为功能性基因的表达单位!根据整合酶基因和获得基因盒能力的差异!目前整合子至少分为)类!临床上研究得最多的是!&&#类整合子!最常见的是!类整合子’基因盒是一种包括单一基因和一个位点特异性重组位点(%TW片段#的结构!它通过整合子的整合酶催化!特异地结合于整合子上!并通过整合子上的启动子作用得以表达!故又称基因盒0整合子系统!其概念于!%%!年由N577正式提出+!,’研究表明细菌整合子可以携带多种耐药基因盒+,!由于细菌可以不断地通过整合酶基因从周围环境捕获耐药基因盒!而使其具有多重耐药性’同时!整合子可以通过存在于质粒&转座子等可移动基因元件!在同种或不同种属之间进行基因的水平转移!从而导致细菌耐药性的传播+*!&,’随着抗生素在临床上的广泛使用!细菌耐药性问题日益严重!过去!人们对细菌耐药性产生的机制主要集中在基因突变的研究!认为重要机制是基因突变的积累产生细菌的耐药!后来发现没有接触过抗生素的病原菌!对抗生素也具有抗性!耐药性也能转移’近年来!由具有捕获及表达外来耐药基因盒能力的整合子系统介导的细菌耐药机制正越来越引起研究者的关注’国内外已有不少关于整合子0基因盒系统流行病学研究报道+(!+,!但未见有奶牛乳房炎来源的大肠杆菌整合子0基因盒系统分子流行病学的报道’本研究主要对自内蒙古和上海两地奶牛乳房炎病例分离的大肠杆菌进行了整合子及基因盒的流行病学调查!分析了菌株携带整合子及基因盒与其耐药表型的相关性’&!材料和方法&E&!材料!,!,!!菌株!试验用菌株为自内蒙古和上海两地奶牛场乳房炎病例分离的大肠杆菌)$株’质控菌株大肠杆菌/?JJ(%购自杭州天和微生物试剂有限公司’!,!,!抗菌药物标准品!氨苄西林&阿莫西林&头孢唑啉&头孢噻呋钠#&诺氟沙星&环丙沙星&达氟沙星&洛美沙星&链霉素&卡那霉素&土霉素&多西环素&氟苯尼考&磺胺对甲氧嘧啶均购于中国兽医药品监察所’氧氟沙星&庆大霉素&阿米卡星&氯霉素&磺胺嘧啶购于中国药品生物制品检定所’多黏菌素3!由本实验室保存’!,!,*!培养基及试剂!酵母提取物&胰化蛋白胨购自K96E公司!XJY引物合成及扩增产物测序由上海生物工程技术服务有限公司完成!WH3]0?@5AMR@=QS购自XS4@;5公司!:$G\G/聚合酶&H()U!和!@$限制性内切酶购自宝生物工程大连#有限公司?525Y5#%\G/]5SV@S&H7ER6@:染色剂&细菌基因组\G/提取试剂盒&离心柱型质粒小提试剂盒和离心柱型琼脂糖凝胶\G/回收试剂盒购自天根生化科技北京#有限公司’!,!,&!仪器!XJY扩增仪N^1/_\公司#&/70WP5_45;@S$$凝胶成像系统/7WP5_88Q@=P公司#&电泳成套设备1_KY/\公司#&隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂#&16UD;@.QS5QDA高速冷冻离心机N@S5D@A公司#&I‘*‘_..W@=0QS4@Q@S[54TE516,$紫外分光仪X3公司#&空气浴摇床北京北方同正科技技术发展有限公司#等’&E!!方法!,,!!菌株耐药性检测!详细内容见文献+’,’!,,!菌株整合子XJY检测!分别以菌株基因组\G/和质粒\G/为XJY模板!按试剂盒使用说明书进行制备’参照FP6Q@等+),的文章设计整合酶基因简并引物!上游(a0?HJHHH?^//YH/?1?02H/???0*a!下游(a0J/YJ/J/?HJH?Y?/Y0/?0*a其中^bJ!?%Yb/!H%1bH!?!J%2bH!?#!可同时扩增!&&#类整合子(a端整合酶基因保守区!预计扩增片段为&%!TW’采用($%[反应体系扩增!含!$c1DUU@S(%[&,(47*[的EG?XA&%[&上下游引物!$%47*[#各!%[&(I*%[39:$G\G/聚合酶$,(%[&模板%[%XJY程序$%(d预变性(468%%&d*$A!(+d&$A!’d($A!*$个循环%’d延伸(468’扩增产物经!-琼脂糖凝胶电泳H7ER6@:染色#后用凝胶成像系统观察’!,,*!整合酶基因扩增产物限制性内切酶分析!参考李心晖等+%,介绍的方法!选用H()U!和!@$对整合酶基因XJY扩增产物进行酶切!根据扩增产物的酶切片段数和片段大小对整合酶基因进行分类’!&&#类整合酶基因XJY扩增产物的H()U!或!@$酶切片段数和片段大小见表!’+&*!!!期王桂琴等$奶牛乳房炎大肠杆菌整合子与耐药表型的相关性研究表&!+’,或-.(#酶切$类整合酶基因扩增产物的片段数及片段大小F.2-,&!45B-06*1890;,8/0*1*/G+,,A019801/,;+.8,;,1,30/G+’,.19-.(#,19*1H6-,.8,8整合酶类型?P@QMW@U_8Q_XJY产物大小*TW.6C@UXJYWSED=QAH()U!酶切\6;@AQ@E:6QPH()U!!@$酶切\6;@AQ@E:6QP!@$片段数GD4T@SUUS5;4@8Q片段长度*TW.6C@UUS5;4@8Q片段数GD4T@SUUS5;4@8Q片段长度*TW.6C@UUS5;4@8Q_8Q_!&%!!&%!!&+&*&(_8Q_&%!*$$&!%!!&%!_8Q_*&%!!!%&*’!&%!!,,&!基因盒检测!参考\D等+!$,设计整合子基因盒插入区引物!上游$(a0H//HHJ/JH//J0JJ/H?HH/J/?//0*a!下游$(a0?//HJ//0J/JJH/J/HHH/?HH/??0*a!以菌株基因组\G/为XJY模板!反应体系同整合子XJY检测!XJY程序$%(d预变性(468%%&d*$A!()d*$A!’d&468!*$个循环%’d延伸’468’扩增产物以!-琼脂糖凝胶电泳分离!用试剂盒回收电泳分离的基因盒插入区XJY扩增片段!连接到WH3]0?载体上并转入大肠杆菌\N(&中!送上海生物工程技术服务有限公司进行\G/测序!最后将测序结果登录H@8158V进行1[/.?!分析整合子携带的基因盒种类和排列’!!结果与分析!E&!整合子检测结果!!分别以菌株基因组\G/和质粒\G/作为模板!经!&&#类整合子的简并引物XJY扩增和产物的电泳分析!结果)$株乳房炎来源的大肠杆菌中!*’株的基因组\G/扩增出整合酶基因片段!*株的质粒上扩增出整合酶基因片段!扩增片段为&%!TW!与预期大小一致见图!#!表明菌株携带整合子!检出率为&+,(-!并且整合子主要存在于质粒上’XJY扩增产物经H()U!和!@$酶切后电泳分析!结果*’株大肠杆菌的整合酶基因扩增产物未被H()U!酶切!被!@$酶切为!