第二代DNA测序技术

第二代DNA测序技术神经生物学张朝政第二代DNA测序技术简介•第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术•核心思想：边合成边测序•特点：读长短、通量高，成本低、测序快•Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台测序原理：焦磷酸测序法—4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应•焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，4种酶混合物（DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶）和底物混合物（包括APS和荧光素）。焦磷酸测序法原理及步骤•第一步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，发生以下反应•第二步：上一步中生成的PPi和APS在硫酸化酶的催化下生成ATP，ATP可使荧光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化，同时产生可见光，光信号强弱与ATP含量成正比，又n（ATP）=n（PPi）=n（加入的dNTP），因此可根据光信号强弱推知加入的dNTP的个数•第三步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的作用下降解•第四步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息454测序流程•（1）DNA文库制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，末端修复后在片段两端加上不同的接头，变性处理回收单链DNA。•（2）体外DNA扩增：454系统采用的是乳化PCR的方法进行扩增。•（3）富集固定：将含有DNA片段的磁珠富集起来，并将这些磁珠置于一种PTP平板中的特制小孔中，每个孔只能容纳一个磁珠。•（4）测序：采用焦磷酸测序法，每个含有磁珠的小孔都可以测出其中一个片段的序列。•Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器•测序原理：类似Sanger测序法，dNTP的3’-OH被化学方法所保护，并带有碱基特异荧光标记，因而每次只能添加一个dNTP，放出一个荧光信号。Illumina测序流程•（1）DNA文库制备：把待测的DNA样本打断成小片段，两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库•（2）体外DNA扩增：Illumina测序系统采用的是桥式PCR扩增•（3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循环即可测出该片段序列。•Solid测序技术是第二代基因分析技术中准确度最高的。•测序原理：基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。连接法测序原理•合成新链所用酶：DNA连接酶•底物：8碱基单链荧光探针混合物—3’-XXnnnzzz-5’，根据XX的不同在探针的5’末端分别标记了4种颜色的荧光染料当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号连接法测序步骤（1）第一次连接反应由连接引物“n”介导，掺入一种8碱基荧光探针后SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息（2）化学处理除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5’磷酸，为下一次连接反应作准备（3）第二次连接反应得到模板上第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息……（4）测到末尾后，将新合成的链变性，洗脱。引物重置，开始第二轮的测序（1）第一次连接引物n-1比第一轮错开一位，所以此次得到0，1位碱基对的颜色信息（2）化学处理后，第二次连接反应得到的是5，6位碱基对的颜色信息，第三次是10，11位碱基对的颜色信息……•这样经过5轮测序后，可得到由颜色编码组成的SOLiD原始序列，只要知道所测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解码”成碱基序列Solid技术测序流程•（1）DNA文库构建：片段打断，并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。•（2）体外扩增：乳化PCR，磁珠直径约1um，在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰（为后面测序做准备）•（3）磁珠富集转至测序玻片•（4）连接法测序454技术Solid技术体外PCR扩增方法磁珠乳化PCR（磁珠直径约28um）桥式PCR磁珠乳化PCR（磁珠直径约1um）测序原理焦磷酸测序法可逆终止物测序（类似Sanger测序法）连接法测序读长差异400-600bp100-150bp50-75bp谢谢倾听！