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:1001-764X(2002)06-0325-04 :R446.1 :A、鄢盛恺(、、,100730):高密度脂蛋白胆固醇;低密度脂蛋白胆固醇;匀相测定法 流行病学与临床研究证实,动脉粥样硬化(AS)、冠心病的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平呈负相关,而与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平呈正相关。美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗专家组(ATP)新近发表的第3版文件(ATPⅢ,2001年)修改了血脂、脂蛋白水平异常的分类,低HDL-C[1.04mmol/L(40mg/dl)]是冠心病的主要危险因素,而高HDL-C[≥1.56mmol/L(60mg/dl)]被认为是负危险因子,具有保护性。将LDL-C新划分为5个水平,仍以降低LDL-C水平作为冠心病防治的首要目标[1]。近年来国内外相继研制开发出一些新型HDL-C、LDL-C的直接测定方法即匀相测定法(homogeneousmethods)试剂,因其简便、快速,易于自动化,已引起关注并广泛应用于临床常规分析[2～5]。1 HDL-C1.1 概述 测定血清HDL-C通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL与其他脂蛋白分离开,再测定HDL组分中胆固醇含量。美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C的参考方法(RM法)为超速离心法,也为NCEP所推荐。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C检测方法学评价。CDC胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)近来选用了一种“指定的比较方法”(DCM法)作为转移CDC参考方法准确性的适用方法———硫酸葡聚糖-镁(DS50-Mg2+)沉淀结合ALBK法。这种方法相对CDC参考方法而言,已大为简化[6]。色谱法和电泳法临床常规实验室应用较少,多用于脂蛋白研究。国外把临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法分为3代[4]。第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为多聚阴离子,如磷钨酸(PTA)、DS、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用。最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法,后多采用DS50-Mg2+法,欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)[2,6]。但此类方法受高三酰甘油(TG)的影响。第2代采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法(美国ReferenceDiagnostics和Polymedco公司试剂),省去了离心步骤,但需特殊装置,试剂不适用于推广应用[7]。第3代为匀相测定法[2,4],标本用量少,不需沉淀处理,可用自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面基本达到NCEP的分析目标,因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。国内情况与国外有些不同,也可分为3代。第1代为电泳法;第2代为化学沉淀法,1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C测定常规方法[8];第3代为目前广泛使用的匀相测定法。1.2 匀相测定法1.2.1 选择性抑制法(polyanionpolymer/detergentHDL-Cassay,PPD法)[2,4,9,10] 亦称选择性遮蔽法。其应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子,根据脂蛋白的酶反应选择性,直接测定HDL-C。试剂Ⅰ中含多聚阴离子和分散型表面活性剂(亦称反应抑制剂),CM、VLDL、LDL在多聚阴离子环境下发生凝聚;由于反应抑制剂与CM、VLDL、LDL的疏水性基团具有高度亲和力,故其吸附在凝聚的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈,抑制其表面的游离胆固醇反应。同时在游离的HDL表面也吸附有少量反应抑制剂,但由于亲和力较弱,其结合是可逆的。试剂Ⅱ中有对HDL颗粒中亲水性基团具高亲和力的可溶性表面活性剂(亦称反应促进剂),其对HDL表面的吸附不仅置换出第一反应中HDL表面吸附的反应抑制剂,而且使HDL形成可溶性复合体,从而使HDL-C可直接与酶试剂[含胆固醇酯酶(ChER)、胆固醇氧化酶(ChOD)等]发生反应。该方法的主要代表试剂盒为日本第一化学(DaiichiPureChemicalsCo.)CholestestHDL和美国GenzymeDiagnostics公司的N-genousTMHDL-C试剂盒。1.2.2 PEG修饰酶法(PEG-modifiedenzymeHDL-Cassay,PEGME法)[2,4,11] 在Mg2+的存在下,α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶的作用;PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与ChER和ChOD共价结合,引起酶的变构,变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性,其顺序依次为LDLVLDL≈CMHDL。而α-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构,从而避免酶的催化作用,这种作用还与Mg2+浓度有关。因此在Mg2+及少量DS存在的前提下,可直接测定HDL-C。主要代表性试剂盒有日本协和(KyowaMedexCo.)、罗氏诊断(RocheDiagnostics)和德国CentronicGmbH公司的产品。1.2.3 清除法(clearancemethod)1.2.3.1 反应促进剂-过氧化物酶清除法(syntheticpoly-mer/detergentHDL-Cassay,SPD法)[4,12,13] 其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加入试剂Ⅰ,在反应促进剂(合成的多聚物/表面活性剂)的作用下,血清中CM、VLDL及LDL形成可溶性复合物,它们表层的游离胆固醇在ChOD催化下发生反应生成H2O2,在过氧化物酶(POD)的作用下,H2O2被清除。加入试剂Ⅱ,在一种特殊的选择性表面活性剂作用下,只有HDL颗粒成为可溶,所释放的胆固醇与ChER和ChOD反应,生成H2O2,并作用于4-AAP色原体产生颜色反应。代表试剂盒是日本第一化学新近推出的325 2002206 ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2002,Vol.20,No.6 :,,1969,,,DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2002.06.001CholestestNHDL试剂盒。1.2.3.2 过氧化氢酶清除法(catalaseHDL-Cassay,CAT法)[4,14,15] 其原理为试剂Ⅰ中具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL及LDL,使其所含的胆固醇暴露,在ChER和ChOD的催化反应下生成H2O2,H2O2被过氧化氢酶(catalase)分解为H2O和O2而被清除。试剂Ⅱ中的叠氮钠抑制了过氧化氢酶活性,另一表面活性剂使HDL颗粒中的胆固醇暴露,并与胆固醇酶试剂发生反应,用标准的Trinder反应即可测定HDL-C。应用两点速率法可减少高胆红素和高TG对测定结果的影响。代表试剂盒是日本生研(DenkaSeikenCo.)和英国朗道(RandoxLaboratoriesLimited)公司试剂盒。1.2.4 免疫分离法(immunoseparationmethod,IS法)1.2.4.1 PEG/抗体包裹法(internationalreagentscorpHDL-Cassay,IRC法)[2,4,16,17] 为最早期由日本国际试药公司(InternationalReagentsCo.)研制的试剂盒(测定过程包括4种试剂)。原理是先用低浓度的PEG4000包裹CM、VLDL、LDL,加入特异性抗apoB、apoCⅢ抗体,使CM、VLDL和LDL颗粒复合物凝聚,然后加入胆固醇酶试剂,用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇(即HDL-C),最后加入盐酸胍试剂,终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物,以免其干扰吸光度测定。1.2.4.2 抗体免疫分离法(antibodyimmunoseparationHDL-Cassay,AB法)[4,18] 由日本和光制药公司(WakoPureChemicalsIndustry)新推出的试剂,其原理与上述方法相似。试剂Ⅰ中的抗人β脂蛋白抗体首先与血清中的CM、VLDL、LDL结合形成不溶性抗原-抗体复合物;加入试剂Ⅱ后,抗原-抗体复合物不与酶试剂起反应,只有HDL-C与酶试剂反应,生成H2O2,并通过Trinder反应测定HDL-C含量。2 LDL-C2.1 概述 测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等,应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开,然后测定LDL组分中胆固醇含量。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。CDC测定LDL-C暂定的参考方法为超速离心法(β-定量法/BQ法),也为NCEP所推荐。此法测定的LDL-C,实际上包括脂蛋白(a)[Lp(a)]和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量,也是评价其他检测方法准确性的基础。Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法,被NCEP推荐为常规测定方法[19]。其以VLDL组成衡定(VLDL-C/TG=0.2,均以mg/dl计)的假设为前提,具有简便、直接、快速等优点。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响,总变异可达9.5%。但在血清中存在CM、血清TG4.56mmol/L(400mg/dl)、血清中存在异常β脂蛋白时[Ⅲ型高脂血症(HLP)]时不宜采用Friede-wald公式法计算。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用,多用于脂蛋白的研究[3,5,19]。国内外将临床常规实验室直接分离测定LDL-C的方法分为3代[5]。第1代为化学沉淀法,常用方法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等[20～22]。这类方法主要缺点是TG水平较高(4.52mmol/L)时,有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。第2代方法有两类:一类为免疫分离法(immunoseparationmethod)[3,5,23～25],美国GenzymeDiagnostics和SigmaDiag-nostics公司已有可供临床应用的直接测定LDL-C商品试剂盒。即用PEG和结合有羊抗人apoE、apoAI多克隆抗体的胶乳珠分离试剂除去HDL(含apoAI/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAI/E),直接进行LDL-C水平测定。此法精密度好,准确度高,特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与β-定量法有较好相关性,不受高TG水平的影响,可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管,试剂成本较高,难以自动化,且不适于冷冻和冻干标本的测定。可用于TG4.56mmol/L的少数患者LDL-C的检测,对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。另一类为简便的磁珠肝素分离法(美国ReferenceDiagnostics公司试剂)[26,27],此方法不需离心,操作简便,精密度高,与Friedewald公式法相关性好,与β-定量法结果一致。但此法所需标本量大,需特殊装置,特异性稍差。第3代为匀相测定法[3,5],标本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面都可达到NCEP的分析目标。国内也可分为3代,但与国外有些不同。国内第1代为电泳法;第2代为Friedewald公式计算法与化学沉淀法,1995年中华医学会检验学会在国内推荐PVS法作为LDL-C测定的常规方法[28];第3代为目前广泛使用的匀相测定法。2.2 匀相测定法2.2.1 透射比浊法[3,29] 罗氏诊断(原BoehringerMannheim)公司基于多聚阴离子试剂PAMPS与LDL颗粒发生特殊凝集反应设计而成的早期试剂。试剂1中的两性离子表面活性剂可使样品中HDL、CM和VLDL(富含TG)颗粒遮蔽。加试剂2[(含触须状多聚阴离子(PAMPS)和两