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RNA干扰技术基本原理与应用什么是RNA干扰RNA干扰(RNAinterference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术基因敲除技术寡核苷酸与双链DNA杂交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术用反义RNA技术阻遏翻译过程,破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质,使mRNA不稳定双链RNA干扰技术（RNAi）RNAi的发现和发展历程1984年,Jonathan研究小鼠L细胞时发现反义mRNA会干扰同源基因的表达，机制不清1990年Jorgensen等矮牵牛颜色加深实验“共抑制(co-suppresion)”RNAi的发现和发展历程1995年SuGuo和KenEmphues反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达实验首次发现RNA干扰现象1998年AndrewFire和CraigMello发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制基因的表达Nature1998；391:806-11正式提出RNA干扰的概念RNAi的发现和发展历程1999年Tuschl等报道在哺乳动物中也存在RNAi2001年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA为siRNAs(short/smallinterferingRNA)的DICER酶RNAi的发现和发展历程2002年Novina等用RNAi技术实现了对HIV-1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制Science2004(August27)；305：1289-1292RNAi的主要特点和优势诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去“基因沉默系统化”siRNA与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶共同点特异性靶向性siRNA与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶不同点独特的双链结构需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同因子siRNA本身无催化活性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性RNAi的主要过程启动阶段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA长度：21-25nt结构：3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU细胞中内源性dsRNA的形成基因组中DNA反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义RNA病毒RNA复制中间体以单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNADicer酶RNAaseIII超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点对单链RNA没有活性对200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA广泛存在RdRp（RNAdependentRNApolymerase）使异常的RNA转变为dsRNA参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增siRNA与靶mRNA的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNARNAi的主要过程效应阶段RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC的激活：ATP依赖的解双链过程在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC特异性切割、降解靶mRNA，导致基因表达失活RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则序列大小19-21nt，最好以A或G开始从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点不要针对5‘和3’端非编码区（untranslatedregions，UTRs)RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则设计2~4个序列,BLAST比对基因序列以确保序列设计的特异性优先选择GC含量30-50%的序列设计适当的阴性对照序列阴性对照序列的设计特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGATTCGTGCTCAATGCAATCG在特异性siRNA引入1~2个错配碱基AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG目标序列筛选的相关网站://sfold.wadsworth.org/sirna.pl://RNAiDesigner.invitrogen.com://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html查找已经证实的siRNA的网站=49://web.mit.edu/mmcmanus/://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=PublishedsiRNA的制备方法体外制备方法化学合成siRNA体外转录获取siRNA利用Dicer或RNaseⅢ消化长的dsRNA成siRNA化学合成法制备siRNA优点：纯度高合成量不受限能被标记缺点：价格昂贵、合成周期长用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究体外转录法制备siRNA优点：简单成本低速度快毒性小稳定性好缺点：反应规模和量始终有一定的限制用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAssiRNA的制备方法细胞内制备方法依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNAsiRNA载体依赖RNA聚合酶III启动子(polIII)，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。人源U6启动子鼠源的U6启动子人H1启动子polIII可在细胞中表达许多的小分子RNA，通过添加一串（3~6个）U来终止转录的需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链再克隆到载体中表达载体法制备siRNA优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表达效率较低用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法基于PCR的siRNA表达框架(SECs)组成：RNApolIII启动子发夹结构siRNARNApolIII终止位点制备：PCR，无需克隆和测序用SECs制备siRNA优点：可直接由PCR得到，方法简便，时间短在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出最有效的siRNA可用于构建表达载体可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配用表达框架制备siRNA缺点：PCR产物很难转染到细胞中不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想用途：筛选siRNA序列在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子shRNA(shorthairpinRNA)文库Nature2004；428：427-431(25March)针对：9,610humangenes5,563mousegenes构建成：28,000个shRNA表达盒(cassettes)商品化试剂盒：ExpressionArrest™(美国冷泉港实验室OpenBiosystems公司)网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程CAM:氯霉素抗性基因hr：同源重组位点Barcode：每个shRNA独特的识别序列MSCV：病毒载体骨架PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列siRNAshRNA使用代价高相对较低持久性最多2周可选择获得稳定整合的细胞宿主类型细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细胞系设计复杂的设计方法完成获取需要合成完成应用瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒侵染检测方法Western杂交、表型分析RT-PCR、芯片检测Western杂交、表型分析、RT-PCR、芯片检测研究领域细胞培养细胞培养&体内研究siRNA转染细胞.磷酸钙共沉淀电穿孔法DEAE-葡聚糖和polybrene机械法：显微注射和基因枪阳离子脂质体试剂提高转染效率的方法纯化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染较低传代数的细胞合适的转染试剂合适的阳性对照荧光标记的siRNARNAi技术的应用基因组功能研究的新方法研究信号传导通路的新途径开展基因治疗的新策略（抗病毒、抗肿瘤等）筛选药物靶点的新工具RNAi技术抗病毒作用阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录自然界中普遍存在在医学上的应用RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒DNA病毒：如HBVRNAi技术阻止HIV的入侵Novina将针对CD4的dsRNA导入能表达CD4、CCR5、CXCR4的Magi2CCR5细胞系），能使细胞表面CD4表达减少75%；转染后60小时后,再用HIV感染,结果发现CD4-siRNA转染的细胞很少有包涵体出现其它试验的受体：CCR5、CXCR4RNAi技术抑制HIV的复制将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制siRNA抑制HIVrev-EGFP的表达，其抑制率可达到90％；而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异RNAi技术抑制HCV的复制NS5B-6133siRNANS3-1948siRNAGAPDHsiRNA+++HCV表达质粒Huh-7细胞共转染HCVRNA↓21倍HCVRNA↓23倍HCVRNA无变化谢谢!