实验十三流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋

大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室实验十三流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡指导教师：唐颖大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室1.实验目的•了解细胞凋亡、及流式细胞技术原理等基本知识。•学习细胞凋亡的形态学观察和流式细胞术检测的方法。•学习流式细胞技术标本的制作方法，了解流式细胞仪的使用。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.实验原理•2.1细胞凋亡的基础知识•2.2流式细胞技术的一般原理及应用•2.3用流式细胞术检测细胞凋亡的原理大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.1细胞凋亡的基本知识：•定义：细胞凋亡是细胞在一定程序控制下的自主死亡过程。细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样是机体生存和发育离不开的最基本的生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目，清除衰老、过剩、有害的细胞。细胞凋亡异常会引起免疫性疾病或肿瘤等。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室（一）、细胞坏死•是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。•早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。•继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。细胞凋亡与坏死的区别大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室细胞凋亡与坏死的区别（二）细胞凋亡cellapoptosisKerr（1972）最先提出，与细胞坏死的区别是：•①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；•②凋亡小体内有结构完整的细胞器；•③不引起炎症；•④线粒体无变化，溶酶体活性不增加；•⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状；•⑥凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室细胞凋亡与坏死的区别大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室胸腺细胞正常凋亡大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室形态学检测流式细胞法检测DNALadder检测荧光法检测凋亡鉴定方法大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.2流式细胞技术的一般原理及应用•流式细胞术(flowcytometry)是以流式细胞仪(flowcytometer，FCM)为工具，在液流系统中对悬液中的单个细胞、细胞器或生物粒子的生物、物理和化学特性进行快速测量并自动分析，并根据这些特性将所需要的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的高技术。•它的主要特点是，可以在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数的定量分析及分选，借此判断细胞的体积、DNA含量、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数，并可在无菌状态下，对活细胞进行分类收集，收集的纯度可达99％。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室流式细胞仪工作原理流式细胞仪（FlowCytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室散射光信号FALSSensorLaser大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource=前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室流式细胞仪的检测信号荧光信号•使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析•荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室荧光信号双色直接染色大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室数据分析=数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等FSCSSCFL1FL2Event13060638840Event210016024585Event3300650160720大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室数据分析=直方图分析大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室数据分析=点图分析大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室数据分析等高图和密度图分析大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.3用流式细胞术检测细胞凋亡的原理•利用流式细胞仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析。凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大，凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小，坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变小。•用流式细胞仪也可以根据DNA含量不同，从细胞群体中鉴别凋亡细胞。凋亡细胞在G1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡峰（Ap峰）。通过此峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率（用凋亡软件定量）。•另外，细胞凋亡受基因调控，有赖于某些蛋白质的合成，用流式细胞仪可同时测定凋亡细胞的FSC/SSC及DNA/蛋白质，进行多参数分析以研究不同的凋亡诱导作用机制。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室3.实验材料、用品•实验材料：培养的Hela细胞•实验用品：①仪器与用具C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜和离心机等。微量加样器(1µl-1ml)，0.5ml和1.5ml的Eppendorf管，20µl、200µl和1ml吸头，10ml培养瓶，载玻片，盖玻片等。②试剂放射线菌素D（诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物，如喜树碱、紫杉醇、中药砒霜等）；荧光探针：用PBS(pH7.4)将PI配成500µg/ml的贮液，在-20℃冻存。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室FACSCalibur,BDBioscience大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4.实验步骤•Hela细胞的传代培养•诱导细胞凋亡：向对数生长期细胞中加入放射线菌素D（可结合科研采用其他诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物）分别为0.25、0.5、1、2、4mg/L,作用6小时。•用胰酶消化以上五个样本以及对照的细胞，吹打收集于离心管中，1000r/min下离心8分钟，倒去上清。•加约1mlPBS重悬细胞，用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中，固定8小时以上。•去上清，用PBS4ml重悬细胞，再1000r/min下离心8分钟，去上清控干液体后加0.3mlPBS，加入RNA酶A至终浓度为50ug/ml，37℃孵育30分钟。•将样品插到冰浴中，停止酶的作用。待冷却后加入50ug/ml的PI1.5ml,放于冰上在冰箱中染色至少30分钟。•3个小时之内在流式细胞仪上检测样品。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室5.实验结果正常凋亡大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室26化疗前后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞化疗前(3.49%)化疗后(94.86%)大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室细胞凋亡——PI分析PI-Fluorescence#Events凋亡细胞正常G0/G1期细胞大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室6.注意事项•细胞数目要充分；为防止细胞成团，可在用流式检测前用筛网过滤。•可结合科研，将课题组项目中研究的一些凋亡诱导剂作为研究对象进行分析。并在此综合实验中掌握动物细胞的传代技术，细胞凋亡的形态学分析及流式细胞技术。大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室7.思考题•制备流式样品需要注意哪几点。•还有哪些检测细胞凋亡的方法？