DNA甲基化检测技术

DNA甲基化检测之甲基化特异性HRM检测技术（Methylation-sensitivehighresolutionmelting）内容提示DNA甲基化的定义及生物学意义MS-HRM检测的原理MS-HRM检测的方法及步骤MS-HRM检测结果分析DNA甲基化的定义在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象。DNA甲基化的形式：DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）CpG岛（CpGIsland）在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpGIslands,CGIs)。正常结构基因组中70%～90%的独立CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。—是结构基因启动子的核心序列和转录起始点CpGisland的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达——基因表达的调控开关DNA甲基化的生物学意义1、转录抑制基因启动子区的甲基化可影响转录激活因子和其识别序列的结合.DNA甲基化的生物学意义2、影响基因表达直接抑制基因表达或甲基化的CpG双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族识别,而后者可通过吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质来改变染色质的活性,以间接方式影响基因表达.3、损伤与修复一方面参与凋亡和修复的基因受DNA甲基化调控,另一方面异常甲基化往往会导致DNA的多种损伤。此外,甲基化还可能直接参与DNA损伤的识别和修复过程.4、其他：甲基化还参与DNA的复制和包装及DNA片段的转座等。基因组甲基化的特点：可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。DNA甲基化与肿瘤的关系肿瘤细胞的特征：癌基因低甲基化——被激活；抑癌基因高甲基化——被沉默甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用基因基因沉默对肿瘤的意义肿瘤类型APC对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、肝癌BRCA1与DNA修复与转录激活有关乳腺癌、卵巢癌CDKN2A/p16周期素依赖性蛋白激酶抑制剂GIT、头与颈部瘤、NHL、肺癌DAPK1钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶;凋亡抑制肺癌E-cadherin增强增殖、侵袭与转移乳腺癌、甲状腺癌、胃癌ER激素抵抗乳腺癌、前列腺癌GSTP1失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用前列腺癌、乳腺癌、肾癌hMLH1缺损DNA错配修复,基因点突变结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌MGMTp53-相关基因，与DNA修复及耐药性有关肺癌、脑瘤P15细胞的过度激活与增殖非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌RASSF1A失去了对G1/S负调控抑制作用肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌Rb不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤VHL错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性肾细胞癌缩写:APC,adenomatouspolyposiscoli;BRCA1,breastcancer1;CDKN2A/p16,cyclin-dependentkinase2A;DAPK1,death-associatedproteinkinase1;ER,estrogenreceptor;GSTP1,glutathioneS-transferasePi1;hMLH1,MutLhomologue1;MGMT,O-6methylguanine-DNAmethyltransferase;RASSF1A,Rasassociationdomainfamilymember1;Rb,retinoblastoma;VHL,vonHippel-Lindau;GIT,gastrointestinaltract;NHL,non-Hodgkin’slymphoma.DNA甲基化与肿瘤的关系MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。Figure：Kaplan–MeierEstimatesofOverallSurvival,AccordingtoMGMTPromoterMethylationStatus.DNA甲基化的检测方法DNA甲基化的检测方法MS-HRM检测技术目前，甲基化检测的方法很多，例如甲基化特异性PCR，Northern印迹法、Western印迹法、免疫细胞化学等，这些检测方法由于需要花费大量时间，成本高等等，在临床推广应用时均存在一定的困难。最新报道了一种基于熔解曲线的高分辨率熔解（HighResolutionMelt，HRM）的新方法，为甲基化的检测带来了新的曙光。用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化状态，可检测低达0.1%的甲基化程度；并且可以根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。MS-HRM检测技术原理采用重亚硫酸盐处理DNA模板后，在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物，这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化，胞嘧啶不发生变化，而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，样品中的GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响，因此，根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度．MS-HRM检测方法及步骤1.引物设计：a)引物需包含１－２个CpG二核苷酸序列；b)CpG二核苷酸序列应尽量靠近引物的５’端；c)引物的Tm值应尽量接近，最好控制在１℃内；d)引物的３’端应包含有１个或多个T碱基，从而确保只有经过重亚硫酸盐修饰的DNA模板得到扩增；e)引物不能有二聚体存在；f)扩增子的长度尽量控制在100bp左右MS-HRM检测方法及步骤1.引物设计：MS-HRM检测方法及步骤2.DNA样本的准备：可使用新鲜组织或石蜡组织样本，一般不使用血液样本；3.仪器选择（一般可进行HRM分析的仪器均可）：如LightCycler480(Roche),RotorGene6000(CorbettResearch),AppliedBiosystems7500FASTreal-timePCRsystem(AppliedBiosystems),LightScannerSystemandtheHR-1instrument(IdahoTechnologies).MS-HRM检测方法及步骤4.DNA样本的甲基化修饰：可使用FFPETissueKit(QIAGEN)对DNA甲基化修饰及回收；3.PCR扩增：a.上样体系b.PCR-HRM反应程序MS-HRM检测方法及步骤a.上样体系：反应体系组分(20μL)加入的体积（μL）10×PCRBuffer(15mMmgcl2)2MgCl2(25mM)0.4dNTP（10mM）0.520×Eva-green饱和染料1.010μmPrimers0.5+0.5Template（5ng/μL）1.0Taq酶(5U/μL)0.2ddH2O14.3MS-HRM检测方法及步骤b.PCR-HRM反应程序：过程温度时间循环数cycles预变性95℃5min1PCR95℃10s5060℃15s72℃25s(收集荧光)HRM95℃1min140℃1min65℃1s95℃每秒检测荧光25次冷却40℃10s1MS-HRM检测结果分析MGMT甲基化检测的标准曲线图MS-HRM检测结果分析MS-HRM检测结果分析Figure1|TheeffectofthePCRannealingtemperatureonthesensitivityoftheATMMS-HRMassay.Thedilutionsofmethylatedandunmethylatedtemplatesareindicatedasfollows:100%methylated-red,10%methylated-blue,1%methylated-greenand0.1%methylated-brownandunmethylated-black.MS-HRM检测结果分析Figure4.TheMS-HRMassayforBNIP3methylation.ResultsoftheBNIP3-MS-HRMassayforfiveclinicalsamplescomparedtothedilutionstandards.Samples1–5showdifferentmethylationlevels.Thesampleshavebeendistributedoverthreepanelstohelpdistinguishtheindividualsamples.谢谢！