搜索
生物化学实验技术生物化学实验技术•实验一、双缩脲法测定蛋白质含量•实验二、紫外分光光度法测定蛋白质含量•实验三、血清γ-球蛋白的分离与纯化•实验四、碱性磷酸酶Km值测定•实验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响•实验六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析•实验七、SGPT活性测定•实验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶•实验九、RNA的分离与鉴定•实验十、DEAE纤维素离子交换层析法分离蛋白质•实验十一、质粒的提取与鉴定实验一双缩脲法测定蛋白质含量【目的要求】•掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。•【实验器材】•中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计【方法步骤】•取中试管3支，按下表操作。试剂（ml）标准管样品管空白管蛋白质标准待测液蒸馏水双缩脲试剂0.1————5.0——0.1——5.0————0.15.0•各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。【注意事项】•1．正确使用微量加样器。•2．取液要准确。•3.做好标记，不要将试管号弄混。【思考题】•1．分光光度计的使用及计算原理。实验二紫外分光光度法测定蛋白质含量【目的要求】•①了解分光光度法的基本原理；•②能较熟练使用紫外分光光度计。•【实验器材】•1．紫外分光光度计。•2．微量加样器。•3．蛋白标准液（1mg/ml）。【方法步骤】•1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓度为1mg/ml的蛋白质溶液。•2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作管号123456蛋白标准液（ml）生理盐水（ml）0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.0•混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制标准曲线。•3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混匀，按上述方法测其吸光度。【结果与分析】•1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。•2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质浓度。•如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。【注意事项】•1．加量要准确。•2．比色皿的正确应用。•3．结果重复3次，取平均值。【思考题】•1．为何要同时测定蛋白280nm和260nm处的光吸收值？（一）血清γ-球蛋白的分离与纯化实验三1．掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3．掌握离心机的正确使用方法。【实验目的】【仪器试剂】试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。【实验原理】1.盐析：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素①电荷(同种电荷相斥）②水化膜（隔离）Pr++++++Pr++++++中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？（2）盐析的影响因素蛋白质的浓度、盐浓度、pH值、温度等。本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。2.层析：待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。3.检测分离效果（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+与其反应呈现黄色或橙色。（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。1．盐析⑴血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白）。【实验操作】⑵将离心管中的沉淀用1mlPBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟（注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。⑴装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。2.脱盐：注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整（2）加样：向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下。（3）收集：加样同时可进行收集，每管收集1ml。收集12管后加紧螺旋夹。回收凝胶和尼龙布等。⑷检测：准备反应板两块。将12管收集液各取1滴分别放入反应板的12个凹孔。一块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。【实验结果】可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。将双色脲反应呈色最深的一管收集液保留供下次实验使用。利用醋酸纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ-球蛋白的纯度。1．使用离心机前注意配平；2．装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整；3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间；4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下；5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。【实验注意事项】【思考题】1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？2.盐析与变性的异同？3．凝胶层析的原理？（二）血清γ-蛋白的鉴定——醋酸纤维素薄膜电泳1.掌握电泳的基本原理；2.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和应用。【实验目的】【仪器试剂】电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。【实验原理】1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH环境下，混合蛋白质中各种成分带电量不同、分子大小不同，在同一电场中泳动的速度不同，导致相同的时间迁移的距离不同而把它们分开。（1）分子越小，泳动速度越快（2）带电量越多，泳动速度越快反之，越慢。2.本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同时鉴定上次实验提纯结果。♁点样γβα2α1清蛋白♁Γ球蛋白1.准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全血清。2.电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压110V，通电40-45min；3．染色：2-5min；4.脱色：直至背景漂净为止。【实验操作】【实验结果】根据电泳区带出现的位置和条数判断是何种血清蛋白，如果只是一条γ-蛋白说明上个实验分离纯化的较好。1．不要用手触摸纤维素膜；2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面；3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘太近，不要重复点样；4．膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极；【实验注意事项】【思考题】如果电泳结果证实γ球蛋白的分离效果不理想，应从哪些方面分析？实验四碱性磷酸酶Km值测定【目的要求】•①了解酶促反应的影响因素；•②掌握Km的意义和测定方法；•③了解底物浓度与酶活性的关系。•【实验器材】•1．可见分光光度计。•2．微量加样器。•3．0.025U/ml的酶液。【方法步骤】•1．取干净试管8支，按下表正确操作：试剂123456780.02M基质液蒸馏水碳酸盐缓冲液0.11.31.50.21.21.50.31.11.50.41.01.50.60.81.50.80.61.51.41.51.41.5混匀置37℃水浴保温5分钟酚标准液酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1充分混匀置37℃水浴准确保温15分钟0.5％铁氰化钾2.02.02.02.02.02.02.02.0•充分混匀后置室温10min，510nm波长下进行比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。【结果与分析】•1．计算各管酶活性单位。D测/D标×0.01•2．计算各管[S]。[S]＝加入[S]量/3.0×0.02•3．进一步计算出各管1/V和1/[S]。•4．将上述数据填入下表数值1号2号3号4号5号6号光密度值V1/V[S]1/[S]以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该酶的Km。【注意事项】•1．本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。•2．各种试剂的加入量要准确。•3．严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其产物量的准确度【思考题】•1．为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？•2．酶促反应的影响因素有哪些？•3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？—Folin-Wu法实验五胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响1.掌握影响血糖含量的因素；2.熟悉测定血糖的原理和方法及临床意义；3.熟悉动物取血的基本操作。【实验目的】【仪器试剂】722型可见光分光光度计、血糖管、奥氏吸管、锥形瓶、注射器等；钨酸钠、浓硫酸、磷钼酸、碱性铜等。用于吸抗凝血,中间为膨大的球体,减少血液和吸管壁的接触面积,尽量避免融血.【实验原理】主要调节激素降低血糖：胰岛素升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、糖皮质激素、肾上腺素1.体内血糖水平主要依靠激素的调节胰岛素(insulin)：体内唯一降低血糖水平的激素肾上腺素：主要在应激状态下发挥调节作用。2.无蛋白血滤液的制备原理本实验采用吴宪氏法测定血糖，要求将血液制成无蛋白血滤液：???2RCOOHNH2+H2WO4RCOOHNH2WO42此方法是生物碱沉淀蛋白质沉淀蛋白质的方法还有哪些？3.利用吴宪氏法测定血糖的原理G+Cu2+△OH-Cu2O+糖氧化物3Cu2O+3H3PO4.2MO3.12H2O6CuO+3H3PO4.2MO2O3.12H2O钼蓝通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！1．动物准备取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重（一般为2～3kg）。2．取血以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml）边摇匀，以防凝固。用干棉球压迫血管止血。【实验操作】3．注射激素后取血(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时间。一小时后再取血。取血后立即腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性休克而死亡。(2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时后再取血。用干燥的奥氏吸管吸防凝血1ml，擦去管尖外面的血液后，慢慢地放于干燥的锥形瓶中,然后吸硫酸8ml,慢慢地加入，随加随摇（不能有气泡产生），此时溶液逐渐变为深棕色，再沿锥形瓶壁加入钨酸钠1ml，随加随摇以充分沉淀蛋白质，混匀后，放置5分钟，然后以2500rpm离心5分钟，倒出上清夜待血糖测定用，此液即无蛋白血滤液。4.无蛋白血滤液的制备：5.血糖值的测定取中试管五支，分别标记，按下表操作试剂空白管标准管胰前胰后肾前肾后无蛋白血滤液0.50.50.50.5G标准液0.5蒸馏水0.5碱性铜0.50.50.50.50.50.5混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，放入冷水浴中冷却。切勿摇动血糖管。各加入磷钼酸试剂0.5ml，混匀，放置10分钟，各加蒸馏水5ml，用42