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常用化学药品检验方法检验仪器的使用化学药品检验室内容：高效液相色谱仪器（高效液相）色谱理论滴定分析法高效液相色谱仪一、结构示意图.二、部件介绍一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。现在的仪器还一般配置有在线脱气机、自动进样器、柱温箱等。制备型HPLC仪还配备有自动馏分收集装置。泵恒压泵、恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。目前应用的基本上是柱塞往复泵。（单元泵、四元泵、高压二元泵）柱塞往复泵使用时的注意事项：1防止固体微粒进入泵体造成磨损。2流动相不应含有对泵体造成腐蚀的化学物质。3泵空转也会磨损柱塞，防止流动相跑空。4压力过高会使密封环变形，产生漏液。5防止流动相中析出盐晶，应开启柱塞冲洗功能。进样器主要部件为定量环及六通阀。使用时应注意：1样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损2进样量应不大于定量环体积的50%3每次分析结束后应冲洗进样阀，现在大部分进样器能自动实现此功能。部分自动进样器还能实现柱前衍生化等操作。（Agilent）色谱柱色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。使用色谱柱时应注意事项：1避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。2应逐渐改变溶剂的组成，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。3一般不能反冲，否则会迅速降低柱效。4使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。5流动相应先脱气，避免气泡进入柱体。6测试基质复杂的样品时，应用保护柱。7定期用强溶剂冲洗色谱柱，清除驻留在柱内的杂质。8保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇后塞紧。高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型（按固定相分子聚集状态和分离机制分）：分配色谱(液-液色谱)；吸附色谱(液-固色谱)；离子交换色谱；空间排阻色谱；亲和色谱等。一、液-液色谱（一）反相键合相色谱化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱1分离机制：分配+吸附疏溶剂理论流动相与溶质排斥力越强，作用时间↑，k↑，组分tR↑流动相与溶质排斥力越弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（十八烷基Octadecylsilyl，简称ODS）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性（RP）底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水（缓冲盐溶液）+甲醇，乙腈，THF4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（二）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力（有分配和吸附两种说法）2．固定相：极性大的氰基、氨基、二氨基、芳硝基等键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小），分离物质也相似•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性，分析极性大物质、酚、羧酸、核苷酸、糖类、氨基酸等•（也可用作反相固定相，氨基柱不能用于分离甾酮、还原糖）二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）1.特点：流动相为液体，固定相为吸附相。2.分离机制：Xm+nSa=Xa+nSmK=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n3.结论：显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大。4.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。三.离子交换色谱法1.分离机制；离子与离子之间的电荷吸引力2.适用范围；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法进行分离。3.交换：KX=[-NR4+X-][Cl-]/[-NR4+Cl-][X-]DX=[-NR4+X-]/[X-]=KX[-NR4+Cl-]/[Cl-]4.结论：a.分配系数D愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大。5.应用：a.分离离子或可离解的化合物。b.主要用于分析有机酸、氨基酸、核酸、多肽等。离子对色谱法1.特点：分离效能高，分析速度快，操作简便.2.分离机制：又称偶离子色谱法，是液－液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。3.分离过程：X+水相+Y－水相↔X+Y－水相KXY=[X+Y－]有机相/[X+]水相·[Y－]水相DX=[X+Y－]有机相/X+水相=KXY·[Y－]水相4.a.可用C18、C8等常用色谱柱；b.庚烷磺酸钠等离子对试剂价格贵.5.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题.主要用于分析离子强度大的酸碱物质。（三聚氰胺）离子对色谱分离过程示意图四、离子色谱法1.固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季铵基（阴离子交换树脂）。流动相:电解质溶液检测器:电导检测器，安培主配件：抑制柱2.流程图：fig3-23.分类a.双柱型：化学抑制型离子色谱法；b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液；4.分离机制（阴离子为例）被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。5.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸、多肽、核酸等均可用该法分析。离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器，离子色谱用的泵是PEEK材料衬里的不锈钢泵。药典品种应用离子色谱法：阳离子交换柱山梨醇及制剂甘油果糖氯化钠注射液甘露醇及制剂利巴韦林及制剂盐酸二甲双胍及制剂苹果酸及制剂富马酸及制剂阴离子交换柱肝素钠及制剂帕米磷酸二钠及制剂氯膦酸二钠及制剂硫酸软骨素钠及制剂色谱柱类型品种个数阳离子交换柱23个阴离子交换柱14个五、空间排阻色谱法1.固定相：凝胶2.机制：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关.3.分离示意图，fig3-3a.排斥极限A点;b.全渗透极限B点相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将按相对分子质量降低的次序被洗脱.4.常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。常压凝胶色谱头孢尼西钠头孢唑肟钠阿莫西林注射用头孢尼西钠注射用头孢唑肟钠阿莫西林胶囊头孢他啶头孢唑林钠青霉素V钾注射用头孢他定注射用头孢唑林钠青霉素V钾胶囊头孢曲松钠头孢替唑钠青霉素钠注射用头孢曲松钠注射用头孢替唑钠注射用青霉素钠头孢呋辛钠头孢噻吩钠青霉素钾注射用头孢呋辛钠注射用头孢噻吩钠注射用青霉素钾头孢拉定头孢噻肟钠苯唑西林钠头孢哌酮钠注射用头孢噻肟钠注射用苯唑西林钠注射用头孢哌酮钠阿洛西林钠美洛西林钠氯唑西林钠注射用阿洛西林钠注射用美洛西林钠注射用氯唑西林钠普鲁卡因青霉素磺苄西林钠注射用普鲁卡因青霉素注射用磺苄西林钠2010版药典二部采用常压凝胶色谱的品种门冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度门冬酰胺酶（欧文）分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度注射用门冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度注射用门冬酰胺酶（欧文）分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度抑肽酶亲水的改性硅胶，高分子蛋白质注射用抑肽酶亲水的改性硅胶，高分子蛋白质乌司他丁亲水改性硅胶，有关物质乌司他丁溶液亲水改性硅胶，有关物质胰岛素亲水改性硅胶，高分子蛋白质中性胰岛素注射液亲水改性硅胶，高分子蛋白质精蛋白锌胰岛素注射液亲水改性硅胶，高分子蛋白质2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种右旋糖酐20亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐20葡萄糖注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐20氯化钠注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐40亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐40葡萄糖注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐40氯化钠注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐70亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐70葡萄糖注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐70氯化钠注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐铁亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布右旋糖酐铁注射液亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布头孢地嗪钠球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量1000~10000），有关物质注射用头孢地嗪钠球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量1000~10000），有关物质2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10µm的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5～10µm球形硅胶。90年代早期，粒径为5µm的高纯硅胶，即所谓的B型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种B型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3µm或3.5µm的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。手性色谱柱的开发。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2µm的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC硅胶基质填料主要为B型硅胶。填料发展史无定形硅胶和键合相硅胶示意图：填料发展史色谱法的应用：液相色谱常用检测器光学检测器：紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射（通用型检测器）电化学检测器：极谱、库仑、安培电学检测器：电导、介电常数质谱检测器选择性检测器：灵敏度较高检测器类型品种个数紫外检测器1333个蒸发光散射检测器28个示差检测器10个电导检测器5个2010版药典二部采用检测器情况色谱法的应用：蒸发光散射检测器优点：适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用UV时灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。适用于组分复杂样品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不同物质，ELSD相应因子的变化比其它检测器要小得多。对环境影响不灵敏，室温下即可操作。没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。与LC-MS的色谱条件一致，可直接进行方法转换。色谱法的应用：蒸发光散射检测器影响ELSD响应的因素载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等影响雾化过程。被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径。被分析物的折射指数、光源发出的光的强度和波长、光电倍增管的位置等影响散射光强度。光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，反映为实验者所观测的峰面积。2010版药典二部应用蒸发光散射检测器的品种妥布霉素硫酸庆大霉素妥布霉素滴眼液硫酸庆大霉素注射液硫酸妥布霉素注射液硫酸奈替米星硫酸小诺霉素硫酸奈替米星注射液硫酸小诺霉素口服溶液硫酸依替米星硫酸小诺霉素片硫酸依替米星注射液硫酸小诺霉素注射液注射用硫酸依替米星硫酸巴龙霉素硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射用硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射液硫酸链霉素硫酸卡那霉素滴眼液注射用硫酸链霉素注射用硫酸卡那霉素大豆磷脂硫酸西索米星胆固醇硫酸西索米星注射液蛋黄卵磷脂色谱法的应用：蒸发光散射检测器图硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：65℃，分流模式）-40.00048.00