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微生物与免疫学实验•主要内容：实验室规则•免疫细胞•油镜的使用•示教片•操作•作业实验室规则•一般规则•“无菌”安全：穿白大衣不能吃东西禁止追跑打闹物品按指定地点存放肥皂洗手，消毒液泡手实验室规则1、只带书籍、文具等实验相关物品进入实验室。2、必须穿工作衣，离室时脱下并反折。3、严禁在实验室吃东西，不得随地吐痰。4、实验中不得随便走动，应保持安静、有序。5、实验器材使用后按要求摆放，有菌的器材按要求浸泡于消毒液中。实验器材如有损坏，及时报告并登记。6、实验完毕应打扫实验室卫生，关闭门窗水电，洗手清洁后方可离室。无菌观念严格贯彻“无菌概念”的培养和训练，严格实施“无菌操作”。实验中如发生意外，如菌液洒在桌面或含活菌的实验器材损坏使细菌溢出，污染衣物手指等，应立即报告老师，及时进行消毒处理。吸过菌液的吸管等要放在0.1%新洁尔灭溶液中，不得放在桌上，更不可冲洗于水槽内。用过的带菌玻片也应放于含消毒液的容器内。吞噬细胞——大吞噬细胞——小吞噬细胞免疫细胞（单核巨噬细胞吞噬大颗粒异物）（中性粒细胞对小颗粒物质的吞噬）大、小吞噬细胞•大吞噬细胞－巨噬细胞•小吞噬细胞－中性粒细胞中性粒细胞（小吞噬细胞）•存在部位：血液、炎症部位（全身），是白细胞中数量最多的一种。•功能基础：溶酶体，过氧化物酶及杀菌物质。•作用：趋化作用吞噬功能•功能：主要吞噬化脓菌•反应时间及寿命：反应时间快，数分钟到几小时，寿命短，平均数小时。单核巨噬细胞•包括骨髓内的前单核细胞，外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。•骨髓内中的髓样干细胞受某些细胞因子的作用发育成前单核细胞。前单核细胞进一步发育成为单核细胞进入血流。然后移行至全身各组织器官内，发育成熟为巨噬细胞。重要功能：吞噬杀伤作用参与和促进炎症反应杀伤靶细胞加工、递呈抗原免疫调节在机体防御和来源于细菌等感染性微生物的免疫应答中发挥重要的作用吞噬过程示教片•大吞噬:单核巨噬细胞吞噬大颗粒异物大吞噬现象1、淀粉溶液注入豚鼠腹腔内2、次日再注入淀粉溶液，1小时后腹腔注入鸡血球悬液3、血球注入后1小时吸取豚鼠腹腔液，瑞氏染色4、油镜观察，可见巨噬细胞内吞噬有鸡血球示教片大吞噬实验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象瑞式染色吞噬了鸡红细胞的吞噬细胞鸡红细胞ChickerythrocytesMΦ操作：小吞噬（中性粒细胞对小颗粒物质的吞噬）•原理：血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。•材料：1.葡萄球菌菌液2.抗凝人血（3.8%枸橼酸钠）、瑞氏染液、双蒸水3.酒精棉球、香柏油•器材：采血针1根/人，棉签3根/人，载玻片1张/人，双凹片2张/2人，抗凝剂1支/桌，细菌1支/桌，酒精灯1个/2人，接种环1个/2人。瑞氏染色法1.瑞氏染料•由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。2.染色原理•既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。•原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。••3.pH的影响（pH6.4～pH6.8）•细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。•4.染色方法和注意事项•（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。•（2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。•步骤•洗手消毒扎手指（一针见血）•一滴抗凝剂双凹片2滴血，用针混匀•点酒精灯取菌环烧3次取3～4环菌液加入血中用取菌环混匀温育（37度）30分钟推片（慢、厚）自然干燥•加瑞氏染液2滴1分钟加缓冲液4滴（染液与缓冲液比为1：2）混匀染10分钟冲洗吸干油镜观察*纸入盆，双凹片、针入瓷缸（前面），油片入玻璃缸（后面）泡手油镜的使用•保护：拿取手式•对光：升聚光器打开光栅反光镜采光•观察：标本固定载物台上低倍镜找到标本低倍镜移开滴香柏油换油镜目镜观察，细调至清晰•使用完毕立即用擦镜纸擦干镜头上的油•原理结果观察油镜检查：寻找中性粒细胞，如果染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而粒细胞的细胞浆则为淡红色。实验报告•大吞噬（巨噬、鸡红细胞）小吞噬（中性粒、细菌、红细胞及其他细胞）小吞噬实验方法注：画图要注意视野、比例、颜色、背景、标注画图：纸入盆，双凹片、针入瓷缸（前面），油片入玻璃缸（后面）,泡手