单向扩散试验

第六章沉淀反应第一节沉淀反应原理及特点沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。与经典的抗原抗体反应相同原理特点抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物第一阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段免疫浊度测定絮状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳沉淀反应可分为三大类型液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验凝胶免疫电泳技术第二节液体内沉淀试验絮状沉淀试验（flocculation）•絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。•方法受抗原抗体比例的影响非常明显•应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型)絮状沉淀试验抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例表最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。免疫浊度测定（immunoturbidimetry）原理1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量2.抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力强并使用R型抗体3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.54.使用增浊剂免疫浊度测定影响因素第三节凝胶内沉淀试验gelphaseprecipitation原理可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。单向扩散试验（平板法）singlediffusiontest原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h观察孔周围是否出现沉淀环。定量试验单向扩散试验（平板法）倾注平板打孔加样放置37℃24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法Mancini曲线：大分子抗原（IgM）时间扩散＞48h，常数K＝C∕d2普通坐标纸曲线Fahey曲线：小分子抗原（IgG,IgA）扩散时间24h常数K＝logC∕d半对数坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线影响因素：•抗体质量•标准曲线，质控血清•结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高•双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分单向扩散试验（平板法）单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清双向扩散试验（平板法）doublediffusiontest原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一双向扩散试验（平板法）应用1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计2.抗原或抗体相对分子量的估计双向扩散试验（平板法）应用3.抗原性质的分析双向扩散试验（平板法）应用4.抗体效价的滴定5.抗原或抗体纯度的鉴定第四节免疫电泳技术immunoelectrophoresistechnique免疫电泳技术优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析＋沉淀反应抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量对流免疫电泳counterimmunolectrophoresis,CIEP原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高8∼16倍技术要点：制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条件3～4mA/cm，30min～1h。对流免疫电泳通电－蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动＋结果分析：•无沉淀线出现则表明无相应的抗原。•沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。•沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。对流免疫电泳火箭免疫电泳racketimmunoelectrophoresis,RIE电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关原理单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术火箭免疫电泳1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。技术要点1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定。3.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。火箭免疫电泳影响因素火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳图①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本-+免疫电泳immunoelectrophoresisIEP原理：区带电泳＋双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散。技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电泳2∼3mA/cm，0.5∼1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散免疫电泳纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比抗血清的的抗体谱，混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率应用免疫电泳示意图-+免疫固定电泳immunofixationelectrophoresis,IFE免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型原理区带电泳＋沉淀反应免疫固定电泳先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应M蛋白成分。技术要点免疫固定电泳示意图左图为IgGκ型,中图为IgGλ型，右为正常SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。免疫固定电泳应用最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。优点