组织培养技术-2012

北京博奥晶典生物技术有限公司第1页共6页illumina转录组测序简明实验流程一、实验基本流程图SamplePreparation&QCEndRepair&A-Tailing&AdapterLigationPCREnrichmentLibraryQCClusterGenerationSequencingbySynthesismRNALibraryConstructionPolyA-mRNApurification&Fragment2ndStrandcDNASynthesis1stStrandcDNASynthesis北京博奥晶典生物技术有限公司第2页共6页二、mRNA建库流程1.材料准备1.1.主要试剂CodeReagentsManufacturerCatNo.1NEBNextUltraRNALibraryPrepKitforIlluminaNEBE7530S2NEBNextPoly(A)mRNAMagneticIsolationModuleNEBE7490S3NEBNextMultiplexOligosforIllumina（IndexPrimersSet1）NEBE7335S4NEBNextMultiplexOligosforIllumina（IndexPrimersSet2）NEBE7500S5RNA6000PicochipAgilent5067-15246HighSensitivityDNAAssayKitAgilent5067-46267RNA6000NanochipAgilent5067-15118QUBITRNABRASSAYKITInvitrogenQ102119QUBITDNABRASSAYKITInvitrogenQ3285510QUBITDNAHSASSAYKITInvitrogenQ3285411KAPASYBRFASTMasterMixUniversal2XqPCRMasterMixKAPABiosystemKK460212DNAQuantificationStandardsandPrimerPremixKitKAPABiosystemKK48081.2.主要仪器设备CodeInstrumentsManufacturerFacilityNO.196-wellthermalcycler(withheatedlid)MJB01-022Bioanalyzer2100AgilentJ06-023QUBIT2.0FLUOROMETERInvitrogenQ328714PeltierThermalCyclerPTC-225MJB01-011.3.主要耗材耗材型号生产厂家一次性吸头0.5-10L,2-200L,100-1000LAxygen一次性薄壁离心管0.2mL,1.5mLAxygenGelBreakerTubes3388-100ISTEngineering5μmfiltertube5388-50ISTEngineering北京博奥晶典生物技术有限公司第3页共6页2.样品准备和QC选择质量合格的TotalRNA作为mRNA测序的建库起始样品，其质量要求通过Agilent2100BioAnalyzer检测结果RIN≥7，28S和18S的RNA的比值大于或等于1.5：1，起始量的要求范围是0.1∽1ug。用QUBITRNAASSAYKIT对起始的TotalRNA进行准确定量。3.建库实验步骤3.1.mRNA纯化和片段化3.1.1.mRNA纯化纯化原理是用带有Oligod(T)的Beads对TotalRNA中mRNA进行纯化。3.1.2.mRNA片段化下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program1，将RNA片段化到目标长度范围；ReagentVolumnforOneReactionProgram1rRNAdepletedtotalRNA5µlProgram1:a)94°Cfor15minutesb)Holdat4°C(pink)NEBNextFirstStrandSynthesisReactionBuffer(5X)4ul(pink)RandomPrimers1ulTotalVolumn10µL3.2.1stStrandcDNA合成根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program2：ReagentVolumnforOneReactionProgram2FragmentedandprimedmRNA15ulProgram2:a)25°Cfor10minutesb)42°Cfor50minutesc)70°Cfor15minutesd)Holdat4°C(pink)MurineRNaseInhibitor0.5µL(pink)ProtoScriptIIReverseTranscriptase1µLNucleasefreewater3.5ulTotalVolumn20μl3.3.2ndStrandcDNA合成根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program3，然后将第2链cDNA合成产物用144uLAMPureXPBeads进行纯化，最后用60µL的Nucleasefreewater进行重悬，取出55.5µL以备下一步使用;北京博奥晶典生物技术有限公司第4页共6页ReagentVolumnforOneReactionProgram3FirstStrandcDNA20µLProgram3:16°Cfor1hour.Nuclease-freewater48µL(orange)SecondStrandSynthesisReactionBuffer(10x)8ul(orange)SecondStrandSynthesisEnzymeMix4ulTotal80ul3.4.PerformEndRepair/dA-tail根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program4;ReagentVolumnforOneReactionProgram4dscDNA55.5ulProgram4:a)20°Cfor30minutesb)65°Cfor30minutesc)Holdat4°C(green)NEBNextEndRepairReactionBuffer(10X)6.5µl(green)NEBNextEndPrepEnzymeMix3µlTotal65ul3.5.AdaptorLigation根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program5、Program6，然后100uLAMPureXPBeads进行纯化后用52.5µL的ResuspensionBuffer进行重悬，再用50uLAMPureXPBeads进行纯化，最后用22µL的ResuspensionBuffer进行重悬，取出23µL以备下一步使用；ReagentVolumnforOneReactionProgramdA-TailedcDNA65µLProgram5：20°Cfor15minutes.(red)Blunt/TALigaseMasterMix15µL(red)DilutedNEBNextAdaptor*1µlNuclease-freeWater2.5µlTotal83.5ul(red)USEREnzyme3ulProgram6：37°Cfor15minutes.Total86.5ulNuclease-freeWater13.5ulAmpureXPbeadspurificationTotal100ul3.6.PCR扩增根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program7，然后再45µL用AMPureXPBeads进行纯化，最后用23µL的ResuspensionBuffer进行重悬，取出20µL以备下一步使用；北京博奥晶典生物技术有限公司第5页共6页ReagentVolumnforOneReactionProgramDNAwithAdaptor20ulProgram7：a)98°Cfor30secondsb)12cyclesof：98°Cfor10seconds65°Cfor75secondsc)65°Cfor5minutesa)Holdat4°C(blue)NEBNextQ5HotStartHiFiPCRMasterMix,2X25µL(blue)UniversalPCRPrimer(10µM)2.5µL(blue)Index(X)Primer(10µM)2.5µLTotal50ul3.7.PCR产物质控用QUBITDNAHSASSAYKIT对PCR产物进行准确定量。(1)2100质控用2100Bioanalyzerchip判断PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求。(2)文库摩尔浓度准确定量通过q-PCR标准品的摩尔浓度对构建的文库进行摩尔浓度的绝对定量，以保证文库上机用量的准确性，采用Illumina推荐的KAPA定量试剂盒（Catno.KK4602）。3.8.混合文库(Optional)根据文库的定量及定性结果将每个library的摩尔浓度统一调整到2nM，然后根据实验设计选择性的将需要混合的library进行等量等浓度混合，保证混合后的library的终浓度也是2nM，体积大于等于10µL，然后将文库进行-80℃保存。三、上机测序1.材料准备1.1.主要试剂CodeReagentsCatNo.Manufacturer1TruSeqRapidDuocBotSampleLoadingKitCT-402-4001Illumina2TruSeqRapidPEClusterKitPE-402-4001Illumina3TruSeqRapidSBSKit(200cycle)FC-402-4001Illumina41PhiXControlKitv3(10lanes)FC-110-3001Illumina1.2.主要仪器设备CodeInstrumentsManufacturer1ClusterGeneration(cBot)Illumina2HiSeq2500Illumina2.文库上机样品准备2.1.准备新鲜配置的NaOH，将其浓度调整到0.1N；取0.1N的NaOH（10µL）不2nM的文库（10µL）的进行混合vortex，离心，室温放置5min，然后冰上放置；2.2.然后将20µL已经变性成单链DNA的Library加入到980µL预冷的HT1(Hybridizationbuffer)中，使文库的终浓度为20pM，冰上放置；北京博奥晶典生物技术有限公司第6页共6页2.3.根据情况将文库再进行稀释，方法如下：FinalConcentration10pM12pM15pM18pM20pM20pMdenaturedDNA500µl600µl750µl900µl1000µlPre-chilledHT1500µl400µl250µl100µl0µl3.Phixcontrol样品准备3.1.Phixcontrol的原始浓度为10nM，用HT1将Phixcontrol稀释到2nM（10µL）的体系，即Componentvolumn10nMPhixcontrol2µLHT18µLTotalvolumn10µL3.2.取0.1N的NaOH（10µL）不2nM的Phixcontrol（10µL）的进行混合vortex，离心，室温放置5min，然后冰上放置；3.3.然后将20µL已经变性成单链DNA的Phixcontrol加入到980µL预冷的HT1(Hybridizationbuffer)中，使Phixcontrol的终浓度为20pM，冰上放置；然后再将Phixcontrol浓度稀释到5pM，即20pM的Phixcontrol（600µL）+HT1（400µL）；4.簇生成使用TruSeqRapidPEClusterKit将Flowcell和准备好的文库在cBot上进行簇生成，即文库中的分子不Flowcell上固定的引物结合进行桥式PCR扩增，然后才能再HiSeq2500上进行测序。5.边合成边测序将完成做好簇生成的