现代分子生物学实验原理与技术

现代分子生物学实验原理与技术第一章绪论第一节基因操作技术1.基因操作技术基因操作技术（重组DNA技术、基因工程）是在DNA水平上阐明生命现象的技术，包括DNA的“切”、“连”、“扩”等。“切”指限制性内切核酸酶切割DNA。“连”指用DNA连接酶连接两个DNA片段。“扩”是指目的DNA在宿主/载体系统中进行扩增。2.实验方案（1）基因操作实验的主要目的有三个：①分离目的基因，获取DNA信息；②分析基因结构；③分析基因功能。（2）试验流程设计首先，应确定使用怎样的研究方案；其次，根据试验规模和研究室情况；最后，根据研究人员生活规律确定试验时间。3.实验方法在设计实验方法时应考虑①能否达到实验目的；②是否符合实验室现状；③是否符合自己的喜好。实验方法精度爱好实验目的经费预算实验周期仪器性能准确性速度确定实验方法时应考虑的因素4.实验遵循的原则①忠于实验流程④设平行对照实验②关注实验要点⑤准确的试剂用量③准备充足的实验材料⑥数据整理注意：⑴第一次实验成功，第二次实验马虎。⑵实验精度：①必须严格按照实验流程进行的操作；②较严格的实验操作，允许5%的变动；③允许20%变动的实验操作；④不需要特别注意的实验操作。⑶酶促反应不顺利时，若加入更多的酶或DNA，结果会越来越糟。⑷不设平行对照实验往往是实验失败的原因。⑸样本标记的零乱也往往是实验失败的重要原因。5.实验材料的准备•购买•利用公共服务机构•接受馈赠写求助信要注意：①你需要什么？②及时、真实的将相关信息告诉对方，不能隐瞒。③通常向论文通讯作者寻求帮助。④写信的稿纸是印有单位标志、名称、电话号码等信息的公函纸。第二节实验室规则与安全⒈实验室规则⑴保持肃静⑵保持整洁⑶严格操作⑷注意节约⑸保证安全⒉实验室常识⑴使用贵重仪器如分析天平、分光光度剂、离心机等倍加爱护，使用前熟知使用方法，使用时严格遵守操作规程，发生故障时，立即关机。⑵凡挥发性、有烟雾、有毒和有气味的实验，均应在通风柜内进行。⑶配制试剂时，应对试剂纯度、结构式、分子质量等特性熟悉，做到“有的放矢”。⑷量瓶是量器，不要用量瓶做容器。⑸洗净器皿应倒置架上，使其自然风干。⒊实验室安全⑴《实验室生物安全通用要求》查看⑵了解电闸、水阀煤气总阀门所在处，离开实验室检查是否关好。⑶使用电器设备时严防触电。⑷使用高温高压锅灭菌时不得离人。⑸使用可燃物，特别是易燃物，应特别小心。⑹凡使用腐蚀性试剂，必须谨慎操作，防止溅出。⑺废液特别是强酸强碱，应稀释后倒入水池。⑻有毒物品应按照实验室规定办理审批手续后方可领取，使用时严格操作，用后妥善处理。⒋实验室急救⑴触电①关闭电源；②用干木棍将导线与被害者分开；③将被害者移至木板上，与地面分离；④急救者必须做好触电安全措施，手脚必须绝缘。⑵火灾隔绝氧气①起火物与水相容：水、湿布、沙土、灭火器等②起火物与水不相容：不可用水⑶烫伤乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染⑷玻璃割伤或其他器械损伤清理伤口，硼酸水洗净，涂碘酒，包扎⑸灼伤皮肤①强碱：大量清水稀释，涂5%硼酸或2%乙酸②强酸、溴：大量清水稀释，5%NaHCO3或5%氨水⑹煤气中毒呼吸新鲜空气思考题：⒈什么是DNA重组技术？其实验的主要目的是什么？答案⒉试分析有些人工作很辛苦，但总得不出理想实验结果的原因。答案⒊如何获得你需要的实验材料（特别是未商品化的材料）？答案⒋什么是《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）？据此生物学实验室可分几级？答案⒌实验室发生火灾时该如何处理？烫伤、灼伤时该如何处理？答案⒍如何处理对环境有污染的试剂？答案第二章仪器操作与溶液配制第一节常用器皿与仪器1、塑料制品Eppendrof管2、微量移液器（枪）使用方法调节时，自大到小。由小值调到大值时，应多调1/3圈，再反调至设定值。3、恒温水浴锅多用于酶促反应，将Eppendrof管插入浮漂中进行反应。4、小型离心机离心甩干是指短时间（1~3s）的离心操作，目的是使附着于管壁的液体沉入管底。5、离心干燥机目的是使DNA样品快速干燥。6、旋涡混合器利用不对称的旋转将管内液体混匀。7、振荡器搅拌离心管内液体，加速难容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不洁器皿。8、真空泵利用真空吸走液体，作用与离心干燥机或凝胶干燥机类似。9、紫外发光装置防护板（贴有起保护作用的保鲜膜）过滤板紫外线可分为短波、中波、长波等类型，短波光线强，对DNA损伤大。实验室一般使用中波，使用时应戴上防护眼镜。因灯管和过滤板有使用寿命，用完后及时关闭。10、一次性手套11、纸巾①防止危险试剂沾到手上。②防止试剂受到污染。吸走残余液体，一般卫生纸就可以。擦拭实验用品（如玻璃板）时，要用专用、不带毛屑的面巾纸。第二节溶液1、实验用水一蒸水：多用于大肠杆菌培养基的制备、电泳缓冲液的配制、器皿的漂洗的实验。二蒸水：用于生物化学及组织培养实验。2、储液3、试剂称量精度一般称量精度为3位有效数字。4、试剂灭菌不可高温高压灭菌的试剂有：①遇热易分解的试剂②易挥发的试剂③有机溶剂④腐蚀性、刺激性强的试剂。问题：1、如何正确使用微量移液器？使用中应特别注意哪些事项？2、如何改变微量移液器的移液量？应自大调到小，还是自小调到大？为什么？答案3、哪些试剂需要高温高压灭菌？哪些试剂不能采用高温高压灭菌？对于不能采用高温高压方式灭菌的试剂如何灭菌？灭菌后试剂如何保存？是否需要分装？答案4、分子生物学实验中，哪些简易仪器或装置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物学实验中，哪些溶液可以用旋涡混合器混匀？为什么？6、配制培养基时，通常使用哪种级别的水？为什么？答案第三章大肠杆菌培养与保存准备1）制作平板（称试剂、溶解、灭菌）2）清洁超净工作台3）配制液体培养基培养平板培养保存穿刺培养液体小量培养（制作初始菌）DNA扩增甘油保存液体大量培养蛋白质表达第一节培养前准备1、大肠杆菌菌株主要来自K12，根据菌体表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分类。2、培养大肠杆菌所需的物品微量移液器液体培养基枪尖盒1）操作台油性记号笔、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接种环、煤气灯、牙签抗生素（-20℃保存）平板（盖子朝上），保持干燥2）灭菌方法高温高压灭菌（培养基、试剂、枪尖、小木棒、牙签等）干热灭菌（玻璃器皿及金属器皿）火焰灭菌（试管瓶口、接种环等）紫外线灭菌（器械及培养基）乙醇灭菌（实验人员手、器械、操作台）3）接种工具接种环用于液体培养基的接种及平板划线。小木棒用于从平板向液体转接细菌。牙签用于从菌落中挑选需要的单菌落。涂布棒用于向平板上涂布液体菌体。固体液体涂布棒小木棒牙签3、培养基种类1）液体培养基用于大量繁殖菌株以提取质粒DNA或表达的目的蛋白质。2）固体培养基目的是使菌落增殖到一定大小，以获取质粒斑或分离出单菌落。3）抗生素配制：A无菌水溶解抗生素，吸入注射器针筒内。B注射器嘴上安装微量过滤器（过滤灭菌）。C按每份1ml量分装到Eppendorf管中，保存于-20℃冰箱。使用：在接种前加入到液体培养基中，在配制固体培养基时，待灭菌后加入抗生素。4、培养基的配制1)液体培养基的配制•小体积LB培养基的配制（2ml为例）材料：试管及瓶塞药匙1L烧杯搅拌器及搅拌转子试剂步骤：①胰蛋白酶10g酵母提取物5g1L烧杯NaCl10g②加双蒸水至刻度，用搅拌器混合均匀。③用分装器分装至试管，每份2ml。④高温高压灭菌，室温保存。•大体积LB培养基的配制（800ml为例）材料：药匙2L三角瓶铝箔纸电动搅拌器及搅拌转子试剂步骤：①胰蛋白酶8g酵母提取物4g三角瓶NaCl8g②加双蒸水至800ml，混合均匀。③高温高压灭菌，室温保存。2)制作平板材料：煤气灯或酒精灯水平台面1L三角瓶铝箔纸直径9cm的培养基药匙试剂琼脂粉步骤：①胰蛋白酶8g酵母提取物4g三角瓶NaCl8g琼脂粉②铝箔纸封口，混匀，灭菌。③待冷却至60℃左右，分装至培养皿。④水平台上凝固。⑤倒置塑料袋中4℃保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷却至60℃，分装前加入。2、直径9cm的平皿，每皿25ml为宜。3、尽量缩短平皿开盖时间，分装的培养基很快凝固，因此操作要快。4、凝结在盖上的水珠可能至污染，故倒转存放。5、氨苄青霉素易失活，添加后的平皿应在数周内使用。第二节大肠杆菌培养1.无菌操作前用70%乙醇消毒台面。2.离酒精灯较近距离进行无菌操作。3.开盖前和开盖后用酒精灯灼烧瓶口2至3次。4.瓶口倾斜，不得垂直向上。5.使用平皿时尽量去除凝结在盖子上的水珠，并不得混淆盖子。1、培养1）小量液体培养材料：接种针或小木棒煤气灯摇床2mlLB液体培养基长有细菌的平皿步骤：①用接种针接种烧红接种针的铂金丝轻触平皿边缘挑起一个菌落灼烧试管口，开盖将铂金丝伸进液体培养基37℃震荡过夜②用小木棒接种灼烧瓶口，取一根木棒木棒挑起单菌落同上2)大量液体培养基材料：煤气灯摇床少量初始菌8mlLB液体培养基步骤：①小量培养数小时至过夜。②稍微打开盛有大体积培养液的三角瓶瓶盖，灼烧瓶口。③打开有初始培养菌的试管口，灼烧，将初始培养菌转入大量培养基中，盖上盖子，再灼烧瓶口。④37℃震荡过夜。3）菌落测定①在煤气灯旁用微量移液器吸培养液，转至Eppendrof管。②打开分光光度计，调整波长至600nm。③吸取未接菌的培养基至比色杯中，调整光吸收值为零。④取Eppendrof管内的菌液于比色杯中，测A600值。4）平板培养划线培养材料：接种针、煤气灯或酒精灯、新的LA平板、菌诱导期对数生长期平台期死亡期结果：A=0.2~1.0时为指数生长期，A＞1.0为平台期。A=1.0为10个/ml。8600600600步骤：①用煤气灯将接种针烧红，轻触平板一侧，冷却。②用铂金丝挑去平板上的单菌落，在培养基表面划线。③再灼烧铂金丝，冷却。④与前面所划线的一部分交叉划线，以减少菌数。⑤重复上步骤。⑥37℃倒置培养过夜。第三节大肠杆菌菌株保存1、平板保存材料：新平板、圆形标签纸、牙签、封口膜或胶带、长有大肠杆菌的初始平皿步骤：①在平板底部贴标签，做标记。②用牙签挑单菌落，接种到平板。③37℃过夜后4℃保存。涂布培养材料：涂布棒、新的平板、酒精灯或煤气灯、菌液步骤：①将平板翻转过来，置于盖上，50℃干燥20至30分钟。②取100ul菌液，滴于平板上。③用涂布棒涂布均匀。④37℃倒置过夜。3、穿刺保存材料：含0.7%琼脂的LB培养基、铂金丝、封口膜、玻璃瓶。步骤：①玻璃瓶内装2/3培养基，灭菌，冷却。②接种针火焰灭菌，在培养基中冷却。③挑取单菌落后刺入培养基底部。④37度下培养12至18小时。⑤盖紧瓶盖，封口膜封口，室温避光保存。2、甘油管保存材料：2ml冻存管、灭菌的80%甘油、封口膜、菌液步骤：①过夜培养2ml菌液后，取1ml至冻存管。②加入200ul80%甘油，混匀。③拧紧管帽，用封口膜封口，保存于-70℃或-20℃。问题：1、用于基因克隆的大肠杆菌菌株主要有哪些？它们各自有什么主要特征？2、配制氨苄青霉素等抗生素时是否需要灭菌？如何灭菌?3、在进行大肠杆菌培养时，何时需要大量培养？何时需要小量培养？4、在大肠杆菌培养过程中，应注意哪些问题？5、当用平板培养大肠杆菌时，培养皿必须倒置，为什么？6、大肠杆菌的保存方法主要有哪些？第四章基因操作中的酶学反应第一节常用酶的保存注意：1、常规储存于-20℃，也有4℃或8℃。2、储存的冰箱不能选用自动除霜类。3、不与通常样品保存在同一冰箱。4、尽可能在短时间内完成全部操作。5、直接在冰箱内吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金属制的冰空盛装Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。第二节限制性内切核酸酶1、定义：是一类识别DNA上3~8个特异核苷酸序列，并产生切割反应的内切核酸酶的总称。2、修饰酶：与限制性内切核酸酶识别的DNA序列相同，产生修饰反应的酶叫修饰酶，主要是甲基化酶。3、限制-修饰系统：限制性内切核酸酶对病毒等外来DNA起切割反应，但自身基因组DNA因修饰酶的修饰作用而不能被切割，这种防御机制叫~1、识别序列Ⅱ型限制性内切核酸酶的识别序列长度通常为4~8个核苷酸，对数具有对称的回文结