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1.2启动子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点•基因包括编码区和非编码区•----转录时的关键RNA聚合酶的作用•----转录时,非编码区和RNA聚合酶结合,催•化编码区转录编码蛋白质(编码序列)调控遗传信息表达的核苷酸序列(调控序列)终止子一、原核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)编码区上游启动子终止子三、基因工程的操作过程1、什么叫目的基因：主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。第一步、目的基因的获取①.从基因文库中获取目的基因②.利用PCR技术扩增目的基因2、怎样获取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库1.什么叫基因文库？寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。2、基因文库的分类基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）包含了一种生物所有的基因包含了一种生物的一部分基因基因组文库与部分基因文库的关系3、部分怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?4.基因文库的构建方法鸟枪法：反转录法：直接合成法⑶根据已知的氨基酸序列合成DNA法：⑵人工合成基因法⑴直接分离基因用限制酶切断成许多片段将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。⑴直接分离基因——鸟枪法鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)的过程⑵人工合成基因法DNA合成仪②直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。①逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。反转录法的过程：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶HDNA聚合酶双链DNA(目的基因)⑶根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因提问：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？•第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA→DNA杂交分子。•第二步，核酸酶H使RNA→DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。•第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。由mRNA反转录形成cDNA的过程•第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA→DNA杂交分子。•第二步，核酸酶H使RNA→DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。•第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。.如何从基因文库中找到所需要的基因？从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。第三步，按Southern(DNA与DNA分子)杂交的方法进行杂交。第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。第五步，从该菌落中再提取目的基因。利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链解释：PCR的扩增过程是怎样的？PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。看p11第二步、基因表达载体的构建：目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。基因表达载体构建过程第二步、.基因表达载体的构建：它们有什么作用？目的基因启动子终止子标记基因复制原点标记基因•位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录mRNA，最终获得蛋白质启动子：•位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，•能终止mRNA的转录标记基因终止子是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？主要考虑以下几方面的因素。（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。填空：基因表达载体的构建——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种基因表达载体的构建图解将所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。第三步将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法基因枪法•基因枪法：适用于单子叶植物，但成本高•花粉管通道法：简便经济花粉管通道法程序：先提纯目的基因，再体外注射入卵细胞或受精卵中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。方法：显微注射法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:第二步使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。（2）方法：•1、导入到植物细胞常用的方法有农杆菌感染法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）和花粉管通道法•2、导入到动物细胞常用的方法是显微注射法•3、导入到大肠杆菌时先用Ca2+处理成感受态，后与溶有载体DNA的缓冲液混合,吸收DNA分子,完成转化目的基因导入受体细胞小结第四步目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交检测—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因方法——DNA分子杂交Sou