土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3细菌脲酶一、课题背景二、研究思路（一）筛选菌株提出的问题—如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路—寻找耐高温环境；原理—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。（一）筛选菌株KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。（一）筛选菌株1、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2、菌株：纯且活状态所保存的菌种。（二）统计菌落数目：1、活体计数法（稀释涂布平板）（1）操作方法：稀释涂布平板→统计菌落数（2）原理：1个菌落→1个活菌（3）统计原则①选30∼300个菌落的平板统计②每个稀释度取3个平板取其平均值为什么？例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值（二）统计菌落数目1、活菌计数法（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。每克样品中的菌株数=（C/V)*MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。为什么？2、显微镜直接计数利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。设置对照—同等条件下，培养空白培养基（三）设置对照1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。四、实验过程（一）土壤取样1、天然培养基和合成培养基：2、土壤取样：（1）取样的位置：土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。（2）取样要求：铲去表层土。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养（二）样品稀释（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30∼300之间。（三）微生物的培养与观察1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d;放线菌:25∼28℃,5∼7d;霉菌:25∼28℃,3∼4d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性(1)作样品系列稀释液(2)用适当的稀释液涂布平板在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。