第二章 生物芯片分类

第二章生物芯片概述目录2.1生物芯片的概念2.2生物芯片的分类2.3微流控芯片2.4微球在生物芯片中的应用2.1生物芯片的概念把生物活性大分子（核酸或蛋白质）或细胞等，密集排列固定在固相载体（硅片、玻片、尼龙膜等）上，形成微型的检测器件。特点：高通量微型化自动化2.2生物芯片的分类基因芯片蛋白质芯片组织芯片1.基因芯片基因芯片又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片。定义：在固相载体上按照特定的排列方式固定上大量序列已知的DNA片段，形成DNA微矩阵。生物芯片中最早发展起来的就是基因芯片，也是应用最广泛的芯片。图2-1基因芯片技术的实验流程●表达差异分析●多态性分析●再测序●生物信息学●数学优化●数据库●标准化提出问题芯片设计芯片制作●直接点样●原位合成试样处理芯片杂交杂交检测数据分析实际应用●PCR扩增●靶基因标记红色上调黄色不变绿色下调对照组（Cy3）实验组（Cy5）2.蛋白质芯片（ProteinChip）1.概念蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在固相载体上成为检测用的芯片，然后用标记了特定荧光的蛋白质或其他分子与芯片作用。蛋白分析技术•高通量•微型化•自动化将多种蛋白质以微阵列的形式固定在固相支持物上，在孵育反应中与样品中靶分子的结合，并用报告分子检测结合信号。蛋白质芯片的特点2.蛋白质芯片的制作点样和固定蛋白探针•抗体•已知特异的蛋白•电泳分离的蛋白•表达文库……固相支持物•醛基化玻片•膜•聚苯乙烯微孔板•三维凝胶……全自动生物芯片点样仪喷点/印点手动芯片点样器芯片的封闭BSA,GlyPBS洗涤根据应用目的分为：蛋白功能芯片蛋白检测芯片3.蛋白质芯片的分类根据密度分为：高密度蛋白质芯片低密度蛋白质芯片检测蛋白的表达；蛋白质之间的相互作用；发现新的药物靶点；疾病诊断等。4.蛋白质芯片的应用3.组织芯片(Tissuemicroarray)（1）概念将数十个甚至上千个微小的组织整齐排列在一张载玻片上，制成高通量的组织切片，形成微阵列，将标记的特定基因的核酸探针或抗体探针与之杂交以检测该基因或蛋白在不同组织中的表达情况。是传统免疫组化实验的综合体。传统的方法和组织芯片的方法比较灵活的研究工具蛋白AAARNA抗体DNA基因组水平转录组水平蛋白质水平操作平台打孔采样装置定位系统组织芯片制备仪（2）组织芯片的制备过程打孔按照打孔数量的多少，组织芯片可以分为：低密度芯片200点中密度芯片200-600点高密度芯片600点受体石蜡块取样点样切片转移（3）组织芯片的研究意义实现高通量的组织样本研究HumanMolecularGenetics,2001,Vol.10,No.7检测特定基因或蛋白在不同组织中的表达变化筛选肿瘤标志物；寻找新的药物靶点。（4）组织芯片的应用2.3微流控芯片1.概念微流控芯片，也称微型全分析系统(Miniatureedtotalanalysissystem，μTAS)，或称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)。是以微管道为网络连接微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件等具有光、电和流体输送功能的元器件，最大限度地把采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等分析功能集成在芯片上的微全分析系统。发展历程：1990年，瑞士的Manz首次提出微流控芯片的概念。厚度：5mm，面积：几平方厘米-十几平方厘米1994年，美国橡树岭国家实验室改进了芯片毛细管电泳的进样方法。1995年，美国加州大学在微流控芯片上实现了DNA的测序。1996年，PCR技术与毛细管电泳相结合。Caliper公司是首家微流控芯片公司。Agilient公司与Caliper公司联合推出了生化分析仪2100.2.优点：（1）能耗低、物耗少、污染小（2）更可靠，更快捷（3）安全性3.微流控芯片的制作技术（1）制作材料刚性材料：如硅、玻璃、石英等刚性有机聚合物材料：如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酯、醋酸纤维素等弹性材料：如硅橡胶（二甲基硅氧烷，PDMS）（2）微流控芯片的制作方法光刻技术刻蚀技术：湿法刻蚀、等离子体刻蚀模塑法软刻蚀其它方法：热压法、激光切蚀法、LIGA技术等除去光刻胶蚀刻保护膜显影保护膜应用光刻胶光掩膜紫外线基片光刻胶图2-2光刻技术的示意（3）微结构的封接用盖玻片将构造好微通道网络的基片进行封闭。热键合（fusionbonding）：玻璃和石英阳极键合（静电键合）4微流控芯片的分析操作样品输入输出信号样品预处理微流路检测器电子控制/信号处理（1）样品制备①超声处理Belgrader等使用微型超声系统裂解炭疽孢子，提取DNA并通过PCR进行检测，整个分析过程在15min内完成。②提取③预浓缩增强信号65倍。（3）流体的驱动驱动和控制机制有无微机械可动部件能够实现阀的功能流速功率源使用流体范围发展阶段压力（薄膜微机械阀泵）有能0~1ml/min通用成熟电渗无能10nl/s~0.1µl/s上千伏电压电解质，并依赖于溶液的pH与离子强度接近成熟EHD（注射泵）无能0~14ml/min几十到几百伏电压导电率低的液体研发阶段表面张力（电化学）无能2.5mm/s几百毫伏电压否原理实验热（气泡）无能0.5nl/min几十伏电压通用研发阶段离心力无能5nl/s~0.1ml/s马达通用研发阶段（2）进样目前在微流控系统中所用的进样方法基本上是先把样品导入到芯片上，然后再用驱动力将样品注射到分离通道中。（4）反应器和混合器（5）分离模式①色谱②电泳③等电聚焦（6）检测技术①光学检测②电化学检测③质谱检测微流控芯片作为高通量筛选的硬件●微制造的微滴定板●微量液体分配器元件基因组学●扩增●分离●杂交，测序蛋白质组学●分离●与质谱仪、X射线衍射、蛋白质相互作用分析相连接细胞分析●细胞筛选●细胞计数与分选●电生理●转染●R&D以及诊断应用（细胞分析仪）2.4微球在生物芯片中的应用1.悬浮阵列技术也称为液态芯片、液相芯片、流式荧光技术。由美国的Luminex公司研发的一种生物芯片平台。它是采用高分子微球作为带有指示染料的固相载体，并结合流式细胞术进行分析的技术。美国Luminex200多功能流式点阵仪是一个高通量、高速度以及多功能生物技术平台，将编码微球技术、激光技术、计算机等多种技术相结合形成的一项新技术。可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。●编码微球●交联探针●加入待测样品，进行检测2.液态芯片的检测原理编码微球：对微球用荧光染料染色的方法进行编码。交联探针：将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针。检测：●将针对不同检测物的编码微球混合，●加入微量待检样本（已标记），在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合。●最后用流式细胞仪进行检测。一类是微球体本身带有的编码荧光，可用来识别不同的编码微球。另一类是报告分子所携带的荧光，这类荧光可以使我们对检测结果进行定量分析。通过两种不同浓度配比的荧光染液，对微球进行编码，得到不同编码的微球。提供成品化微球、每一种编码微球对应一种待测物。比淋巴细胞略小，肉眼不可见100种编码微球最常用的是羧基化微球，可与蛋白质的氨基或核酸的氨基共价交联。蛋白质共价交联核酸共价交联免疫反应杂交反应红色激光束（635nm）激发微球体上的编码荧光，可使计算机区分出微球的编号，并判定每个微球所代表的检测种类。绿色激光（532nm）激发该编号微球上的报告荧光，测定荧光强度，通过计算机处理后获得待测物质的种类和含量。当单个微球通过检测通道时，双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，并将结果转换成数值输出。3.液态芯片技术的特点通量高：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行不同的分析在35-60分钟内可对100个不同样本进行检测。灵活性好：可适用于各种蛋白质与核酸分析可以自行设计分析方案，也可以使用成套试剂盒。灵敏度高信噪比高重复性好使用带有不同色彩编号的微球,标记上不同的探针分子，加入同一个样品检测体系中，检测不同的被检测分子。反应后通过激光检测微球的编号可将不同的反应区分开来。高通量：同时对多个分子进行检测通量高：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行不同的分析在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测灵活性好：可适用于各种蛋白质与核酸分析可以自行设计分析方案，也可以使用成套试剂盒灵敏度高：可达0.01pg/ml信噪比好重复性好固相动力学液相动力学通量高：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行不同的分析在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测灵活性好：可适用于各种蛋白质与核酸分析可以自行设计分析方案，也可以使用成套试剂盒灵敏度高:可达0.01pg/ml信噪比好重复性好灵敏度高通量高：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行不同的分析在35-60分钟内可对100个不同样本进行检测灵活性好：可适用于各种蛋白质与核酸分析可以自行设计分析方案，也可以使用成套试剂盒灵敏度高：可达0.01pg/ml信噪比好重复性好重复性好4.液态芯片技术与传统的ELISA比较xMAPELISA同时对多个被检测分子进行分析的能力*****-灵敏度小于10pg/ml20-100pg/ml稳定性和重复性********实验时间/操作的复杂程度*******真实性能避免由于酶联放大技术使信号失真导致的假象不能5.液态芯片与固相芯片的比较灵活性更好：可以根据需要调节每次检测所需要的微球的数量和调整检测体系的设计。液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象和活性，也更有利于探针和被检测物的反应。在大多数的反应中不需要洗涤步骤，不会破坏反应的动态平衡。肿瘤标志物的检测6.液态芯片的应用上海透景公司掌握：1）生物芯片的概念及特点；2）生物芯片的分类；3）蛋白质芯片及组织芯片的制作过程；4）微流控芯片的概念及制作方法；5）液态芯片的原理。