基因工程一轮复习课件

知识点一基因工程的基本操作工具1．限制性核酸内切酶(1)来源：主要从生物中分离纯化而来。原核(2)作用：识别特定的并切开相应两个核苷酸之间的。(3)结果：产生或平末端。核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端2．DNA连接酶恢复被限制酶切开的磷酸二酯键结果连接________________连接黏性末端功能T4噬菌体___________来源T4DNA连接酶E·coliDNA连接酶常用类型大肠杆菌黏性末端和平末端3．载体(1)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)具备的条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接；③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。(3)种类：①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子；②噬菌体③动、植物病毒一、基因工程的基本工具[判断正误](1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。()(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端和平末端两种类型()(4)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来。()(5)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()(7)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。()×√√××√√1．与DNA重组技术相关的酶(1)几种酶的比较：种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键DNA重组技术的基本工具种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子(2)限制酶与DNA连接酶的关系：①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。②DNA连接酶起作用时不需要模板。1．限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。2．目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。3．基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。4．并非所有个体都可作为乳腺生物反应器操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白质含量等都是应该考虑的因素。【关键一点】(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(3)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。[典例1](2010·江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点↓GGATCCCCTAGG↑↓AAGCTTTTCGAA↑↓GAATTCCTTAAG↑↓CCCGGGGGGCCC↑(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_________。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在______的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。[答案](1)0、2(2)高(3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞(7)蔗糖为唯一含碳源二、基因工程的操作程序(1)目的基因的获取①从中获取②利用扩增③通过化学方法人工合成↓(2)基因表达载体构建组成①目的基因②③终止子④基因文库PCR技术启动子标记基因1．基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径：①从自然界现有的物种的细胞中分离出来，如从基因文库（cDNA文库）中获取。②人工合成目的基因：常用的方法有反转录法和化学合成法。③利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。基因工程的基本操作程序及与蛋白质工程的比较PCR技术：是利用DNA复制的原理PCR循环高温变性中温延伸低温复性PCR90~95℃55~60℃70~75℃(2)基因表达载体的构建：【关键一点】(1)插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。(2)两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。↓(3)将目的基因导入受体细胞方法①植物：、基因枪法、②动物：技术③微生物：感受态细胞法↓农杆菌转化法花粉管通道法显微注射(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子受体是植物细胞时，还可以用花粉管通道法、基因枪法2．将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。结合图1、图2、图3，结合教材内容完成下列思考。(1)结合下图理解农杆菌转化法的过程：(4)目的基因的检测与鉴定①利用技术检测目的基因的有无②利用技术检测目的基因的转录③利用检测目的基因的翻译④利用的检测鉴定重组性状的表达DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原—抗体杂交个体生物学水平(4)目的基因的检测与鉴定：类型检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)杂交带转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交(DNA和mRNA之间)杂交带翻译检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原－抗体杂交杂交带个体生物学水平检测包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同等2．基因工程与蛋白质工程的比较项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造联系只能生产自然界已有的蛋白质可生产自然界没有的蛋白质结果区别基因工程蛋白质工程项目区别与联系1．[2014·天津卷]嗜热土壤芽胞杆菌产生的β葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时，选用________________________基因组DNA作模板。(2)下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______和______不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为____________。注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同【高考随堂体验】Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会__________；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在________(单选)。A．50℃B．60℃C．70℃D．80℃图1温度对BglB酶活性的影响图2BglB酶的热稳定性注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中________(多选)。A．仅针对bglB基因进行诱变B．bglB基因产生了定向突变C．bglB基因可快速累积突变D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变【答案】．(1)嗜热土壤芽胞杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C2．[2014·新课标全国卷Ⅱ]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了______________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。全部部分筛选乙表达产物耐旱性同源染色体的一条上36．[2014·山东卷]人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：(1)htPA基因与载体用________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用____________技术。(2)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其________。采集的精子需要经过________，才具备受精