实验八凝胶过滤法分离蛋白质

二．原理分子筛层析molecular-sievechromatography凝胶过滤层析gel-filtrationchromatography分子排阻层析molecularexclusionchromatography凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开。凝胶过滤介质不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelP）。凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。蛋白质分子直径凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。交联葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。蠕动泵记录仪部分收集器梯度制造仪层析柱检测仪洗脱液G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离范围Mr（肽和球蛋白）SephadexG-251000-5000SephadexG–501500-30000SephadexG–753000-70000凝胶过滤层析特点设备简单，操作方便分离条件温和，样品回收率高（100%）实验重复性好除盐选择孔径小，交联度大的凝胶。SephadexG-25全排出的最小分子量为5000SephadexG–50全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。）当分子量未知时，选择SephadexG-25洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图三、器材与试剂1×20cm层析柱、自动部分收集器，蠕动泵葡聚糖凝胶Sephadex-50蒸馏水三角铁架4mg/ml蓝色葡聚糖溶液(200万）6mg/ml细胞色素C溶液（几万）样品混合液2mg/ml重铬酸钾溶液（几百）四、实验操作1、凝胶溶胀取SephadexG-5015g，加500ml蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1h）。待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使流速下降和分离效果降低。实验操作2、装柱取1×20cm层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水(赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡)，在蒸馏水高度约占层析柱高1/3时，关闭下端出口（用橡皮筋）。自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm。用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面)。装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。3、加样：取4mg/ml蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合--------上柱样品。打开下端出口，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面(不要使平整的床表面搅动)。打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，关闭下端出口。滴加蒸馏水使凝胶柱上端有2cm水柱。实验操作4、洗脱和收集打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蠕动泵流速，流速0.33ml/min(3分钟1ml，不能让凝胶表面露出水面)。设置部分收集器参数，每3分钟收集1管。取小试管20支，每管收集1ml，观察三种颜色出现的管号，用+，-或5，4，3，2，1，0数字表示颜色深浅。实验操作5、绘制洗脱曲线。实验操作543210凝胶再生和保存Sephadex，Sepharose-----多糖，微生物----酶--------水解糖苷键各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌-----冰箱（冰点以上）保存数月防腐剂：0.02%叠氮化钠高压蒸汽灭菌：0.1MPa，30分钟长期保存凝胶------低浓度酸或碱溶液短期浸泡------水反复洗涤去杂------过滤抽干------50%乙醇------70%------90%------95%乙醇逐步脱水，60~80ºC烘干------装瓶保存注意：溶胀凝胶不能直接高温烘烤交联度越小，越难以脱水，可以将其较长时间浸泡在60-70%乙醇中脱水五、注意事项接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液装柱要均匀，不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。绢布、塑料密封圈六、思考题根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验与教训，完成实验报告。比较几种蛋白质分离方法的特点。