实验六、蚕豆根尖微核检测技术

实验六、蚕豆根尖微核检测技术（３学时）（综合性、设计性实验）一、实验目的1．了解染色体畸变的各种类型、微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义2．学习蚕豆根尖的微核测试技术二、实验原理微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1／3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。三、实验材料松滋青皮豆（蚕豆）种子四、实验器具、药品试剂实验器具：显微镜，计数器，镊子，载玻片，盖玻片，烧杯，瓷盘等。实验药品：6mol/L盐酸，甲醇，冰乙酸，醋酸洋红，EMS(甲基磺酸乙酯)处理液：150,200mmol/L2种处理浓度。NaN3(叠氮钠)处理液：0.5,1.0,1.5mmol/L3种浓度。CrO3：1.0，2.5mol/L2种处理浓度污水：五、实验方法1．实验材料的培育蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对诱变因子反应敏感。松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中筛选出来的一种较为敏感的品种。本品种引入后在栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒农药、以保持该品种较低的本底微核值。也可用其它蚕豆品种，但是必须设置对照组。种子成熟后，晒干贮藏于干燥器内或4℃冰箱内备用。2．浸种催芽：将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两次．所换水应25℃预温。种子吸胀后；用纱布松散包裹置白磁盘中，保持湿度，在25℃温箱中催芽12－24小时，待初生根长出2—3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的磁盘中，25℃继续催芽，经约36～48小时．大部分初生根长至1～2cm左右，根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。3．处理每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。阳性因子可采用CrO3（1.0和2.5mol/L）、NaN3（0.5、1.0和1.5mol/L）或EMS（150和200mol/L），另取一处污水作待检测物质，用自来水作对照，共9个处理，处理根尖6～24h(处理时间可视实验需要和被测液浓度而定)。4．根尖细胞恢复培养将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2－3min。将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内25℃温箱中恢复培养22－24小时。5．固定根尖细胞及制片(参考根尖压片法)(1)将恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的幼根。用卡诺氏液固定24h，固定后如果不及时制片，可换入70%的乙醇中，置4℃冰箱内保存备用。6．酸解：从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗３min→吸水纸吸干→放入盛有适量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离10min。7．染色改良石炭酸品红染色：解离后材料水洗3min并吸干，挑取1个根尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴染液，染色10～15min，压片。8．压片在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。9．镜检及微核识别标准首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核识别标准：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。六、实验数据的统计处理和污染程度划分将实验数据按以下步骤进行统计学分析处理：1．计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）如果对照本底MCN‰为10‰以下，可采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度：MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染；MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染；MCN‰在18‰－30‰区间，则表示有中度污染；MCN‰在30‰以上，则表示有重度污染；也可以采用“污染指数”判别：此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，方法如下：污染指数在0－1.5区间为基本没有污染；污染指数在1.5－2区间为轻度污染；污染指数在2－3.5区间为中度污染；污染指数在3.5以上为重度污染；如果对照本底MCN‰为10‰以上，可采用t检验（被测样品较少时）检测处理液致畸效果是否明显，或以F检验（被测样品较多时）检测各处理之间是否具有显著的差异。七、注意事项：1.各种诱发微核的处理试剂具有一定毒性，请注意使用安全，并防止污染环境。2.凡数值在上下限时，定为上一级污染。3.对严重污染的水环境进行检测时，检测处理会造成根尖死亡，应稀释后再作测试；4.在没有空调恒温设备时，如室温超过30℃，MCN本底可能有升高现象，但可经污染指数法数据处理，不会影响检测结果。蚕豆根尖微核检测记录表试验号镜检日期镜检者片号第一片第二片第三片各自观察的细胞数或微核数细胞数微核数细胞数微核数细胞数微核数总计平均微核千分率