生物催化与生物转化II

水解反应酶的概念及其催化反应的特点酶催化与微生物催化的差异酶的来源酶的分类分子手性的表示方法分子的手性与药物药理、药效和安全之间的关系酶催化反应的过程常用酶及其催化反应的类型和特点水解酶(hydrolases，EC3.x.x.x)是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的65％。它们能水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物。生物催化的水解反应类型如图8—1所示，其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。第一节水解反应的机理和特点酶催化底物水解反应的机理与底物在碱性条件下的化学水解反应机理很相似。丝氨酸型水解酶活性中心的Asp、His、Ser组成三联体，其中丝氨酸的羟基作为亲核基团向底物酯或酰胺中的羰基碳原子发起亲核进攻，形成酶-酰基中间体，见图8-2(a)：然后其他亲核试剂(水、胺、醇、过氧化氢等)进攻酶-酰基中间体，酶将酰基转移到酰基受体上，酶自身恢复原形，见图8-2(b)。微生物脂肪酶(1ipases)在水解反应中使用较多，而猪肝酯酶(pigliveresterase,PLE)和马肝酯酶(horseliveresterase，HLE)使用相对较少，这些酶对羧酸酯具有高度的立体选择性。乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase，ACE)对非天然酯的水解表现出很高的立体选择性，但是这种酶是从电鳗中分离纯化制备的，价格昂贵，限制了它的使用。完整微生物细胞能高选择性地催化酯水解，但实现该反应的条件复杂。一种来自微生物的羧酸酯酶NP(carboxyl-esteraseNP)已可用基因工程法表达制备，该酶能催化某些特殊结构酯高选择性水解。许多蛋白酶同样能选择性水解羧酸酯，使用最多的是α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)。使用相对较少的有胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶(pepsin)、木瓜蛋白酶(papain)和青霉素酰化酶(penicillinacylase)。第二节酯水解一、酯的结构类型酯酶和蛋白酶催化的底物酯按其结构特征分为I型酯和II型酯，它们的结构特征见图8-3。I型酯的手性中心在羧酸部分，Ⅱ型酯的手性中心在醇基部分。无论是I型酯还是Ⅱ型酯，酯酶和蛋白酶都要求底物分子中的手性中心尽可能在水解反应位点附近，以保证其手性识别。猪肝酯酶(pigliveresterase,PLE)是常用的一种酯酶。这种酶成复杂，一般至少有5种同功酶组成，每一个同功酶又是由三个亚基组成。由于它们具有相似的立体选择性，因此，这一粗酶混合物仍被视为是一种单纯酶，但最近也有一些关于它们差异性的报道。PLE的选择性与酶的来源和酶的制备方法有关。对于有机合成反应来说一般采用酶的丙酮粗提物，这种粗酶价格便宜、稳定性好。这是由于化学反应体系中一般为单一底物，故而对酶的底物专一性要求不高。然而在生物体内由于细胞内存在大量的底物和各种酶，因此要求酶具有高的底物专一性。从马肝中提取的马肝酯酶(horseliveresterase，HLE)以及来自于鸡、豚鼠、大鼠、仓鼠的酯酶底物专一性都不高。而兔肝酯酶的底物专一性比PLE在某种程度上要好得多，但这些酶来源有限、使用较少。1．反应条件温和PLE可在温和反应条件下催化乙酸环丙酯、前列腺素E1甲酯水解，如果用化学法水解(酸解或碱解)这类酯，则很容易导致分解反应的发生，见图8-4。这一特性已被成功地用于前列腺素El(1)合成过程中最后的羧基脱保护反应，见图8-4。2．区域选择性酯酶催化水解反应具有区域选择性，PLE能区域选择性地催化苹果酸二甲酯(2)的1-羧酸酯发生水解反应。同样，由外式和内式-双环[2.2.1]庚酸乙酯组成的混合物(3)，PLE只能水解混合物中位阻较小的外式羧酸酯，而内式羧酸酯则不能被水解，反应后生成(4)和(5)，两者很容易被分离纯化，见图8-5。酯酶可选择性水解顺、反(E／Z)烯酸酯异构体，其他的水解酶(如蛋白酶、脂肪酶)却很少具有这种区域选择性，一般水解成二元酸。(二)I型酯的水解1．潜手性二酯猪肝酯酶(PLE)和α-胰凝乳蛋白酶可催化潜手性3-位取代的戊二酸二甲酯(9)的不对称化。鲁氏不动杆菌(Arthrobacterlowefii)和节杆菌(Arthrobacter．sp)的完整细胞具有酯酶活性，也能催化这类反应，但两者催化反应的立体选择性相反，分别产生不同构型产物(10)和(11)，见图8-8。α-甲基-L-α-氨基酸是一类手性合成源，可用于手性药物合成中。它们与天然氨基酸结构不同，不能采用常规氨基酸衍生物拆分法来制备。酯酶能催化潜手性二羧基二甲酯选择性水解为手性单酯(8)，然后单酯(8)中的羧基通过Cudius重排反应可转化为氨基，最后PIE再将单酯水解生成光学纯α-甲基—L-α-氨基酸，图8—9。(三)Ⅱ型酯的水解1．内消旋环状二醇二酯水解酶能催化内消旋单环二醇羧酸酯对映选择性水解，环戊烯-1,4-二醇二羧酸酯(14)能被PLE水解得到高光学纯度的手性单酯化合物(15)。手性环戊烯二醇类衍生物是前列腺素及其衍生物合成的起始原料。酯分子中酰基部分对酶的催化活性有着很大的影响，当起始底物中酰基链增大时，酶水解产物单酯的光学纯度下降，例如双乙酸酯的水解产物对映体过量率巴e.e为86％，而双丁酸酯的水解产物e.e则下降为33％，见图8-13。乙酰胆碱酯酶(ACE)催化环戊烯二醇二酯水解反应具有很高的立体选择性，其产物(16)的立体构型与PLE水解产物的构型相反。环大小的变化将影响ACE所催化水解反应的立体选择性。ACE催化内消旋六元环二醇二酯水解产生消旋体产物(17)，而催化内消旋七元环二醇二酯水解产生单一对映体(18)，其对映体过量率接近100％，但该酶催化内消旋体五元环二醇二酯水解则产生相反构型的单酯(16)，产物的对映体过量率约为99％，见图8-14。三、微生物酯酶完整微生物细胞能直接用于催化酯立体选择性水解，枯草杆菌、产氨短杆菌、凝结芽孢杆菌、豆酱毕赤氏酵母和黑色根霉等是常用于酯水解的微生物。1．外消旋仲醇酯的水解微生物生物转化存在代谢反应控制问题，利用冻干面包酵母中的酯酶进行静态细胞培养法生物转化可有效地抑制其他副反应。外消旋体乙酸-1-炔-3-醇酯(35)和外消旋泛解酰内酯的乙酸酯(36)均可用冻干面包酵母催化拆分，产物的对映体过量率与取代基性质有关，见图8-20。四、具有酯酶活性的蛋白酶1．α-胰凝乳蛋白酶•α-胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶可催化许多非天然酯立体选择性水解。•对于I型酯类底物，α-胰凝乳蛋白酶要求底物分子中手性中心相连的基团必须有一个为亲水性、另一个为疏水性。α-胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶同样可用于区域选择性催化水解反应。α-胰凝乳蛋白酶可选择性水解脱氢谷氨酸二甲酯(42)的1-位酯基，而木瓜蛋白酶则选择性水解5-位酯基，见图8-23。2．枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶可立体选择性水解酯类化合物。枯草杆菌蛋白酶选择性催化天冬氨酸或谷氨酸二苄基酯(43)的1-位酯基水解。枯草杆菌蛋白酶还能高选择性地催化丙烷-1，2，3-三羧酸乙酯(44)中的2—位酯基水解，见图8-243．青霉素酰化酶青霉素酰化酶可高选择性地水解苯乙酸酯，因此可用于除去苯乙酸的保护基。苯乙酸与伯醇或仲醇均可形成酯，青霉素酰化酶优先水解酯分子中醇基部分与天然青霉素G母核空间结构相似的底物.五、脂肪酶脂肪酶能催化甘油三酯水解为脂肪酸和甘油，它们在食品和油脂加工以及手性中间体制备中有着广泛的应用。在生物催化反应中，有30％以上的研究涉及到脂肪酶，这类酶在手性技术中正发挥着越来越重要的作用。脂肪酶除了催化水解反应外，还能催化酯合成反应。(一)脂肪酶水解反应的特点脂肪酶催化反应的分子机理与蛋白酶和酯酶不同。酯酶催化反应速度与底物浓度的关系符合米氏方程曲线，而脂肪酶则表现出S形曲线，见图8-28。(六)其他脂肪酶生物转化反应中使用较多的脂肪酶是PPL、CRL、PSL、MSL，还有一些其他脂肪酶正在研究开发中。曲霉属脂肪酶(Aspergillussp．1ipase,ASL)能催化具有空间位阻的酰氧基酯类消旋体的拆分。分子中引入含硫原子的酰基可以显著地改进ASL催化反应的立体选择性。氰醇是拟除虫菊酯制备的重要原料，也是手性α-羟基酸、α-羟基醛、氨基醇合成的中间体。光学纯氰醇可通过微生物脂肪酶拆分它的消旋体酯来制备。在拆分反应中，酯水解产生的氰醇会原位消旋化，因此只有不被水解的底物才能获得高光学纯的对映体。第三节环氧化物水解环氧化物是一类重要的有机化合物，是许多生物活性物质合成的原料。一般可用化学法制备环氧化物，但反应的立体选择性不高。环氧化物水解酶能催化环氧化物进行区域和对映选择性水解，从而通过生物拆分法制备所需构型的环氧化物。生物催化的烯烃环氧化反应也能直接制备光学纯环氧化物，但是这项技术需要发酵设备和复杂的后处理工程。环氧化物水解酶在生物体内的外源性化合物代谢中起着重要的作用。在活细胞中，芳香烃和烯烃类化合物可以通过两种不同的途径代谢。在低等原核细胞(如细菌)中，双氧酶催化分子氧环加成到芳香环碳碳双键中形成芳基二氧杂环丁烷，然后再被还原酶还原为顺式连二醇。在高等真核细胞(如真菌、哺乳动物)中，芳香环碳碳双键则被氧化为环氧化物，环氧化物具有强的亲电性，是一类强烷化剂，具有毒性、致畸和致癌作用，与生物细胞不相容。为了消除它们的影响，细胞内的环氧化物水解酶能使之转化为生物惰性的反式连二醇，使代谢物水溶性增加，并能被生物体进一步分解代谢和排泄，真核细胞内的环氧化物水解酶多数位于肝脏内，它们负责外源性化合物的解毒作用一、肝微粒体环氧化物水解酶肝细胞中已确定存在两种环氧化物水解酶：微粒体环氧化物水解酶(microsomalepoxidehydrolase，MEH)和胞质环氧化物水解酶(cytosolicepoxidehydrolase，CEH)，两者对底物的选择性不同。一般常用MEH作为生物催化剂，它对非天然环氧化物具有高的反应活性和立体选择性。2．末端环氧化物的水解环氧化物水解酶的使用受到底物在水溶液中稳定性的影响，一些环氧化物在酸性或碱性pH值条件下不稳定，会自发性水解。这种水解过程没有选择性，因而最终产物的光学纯度差。取代基R的性质对反应选择性有很大的影响，直链烷基环氧乙烷不能被有效地拆分，而支链烷基则可增加反应的选择性，见表8-5。另外，增加底物浓度也可提高反应的选择性3．非末端环氧化物的水解环氧化物水解酶能催化顺式构型的非末端环氧化物立体选择性水解。4．环状环氧化物的水解环氧化物水解酶能催化内消旋顺式1，2-环氧环烷(81)不对称水解产生反式环烷连二醇，对肝环氧化物水解酶的研究虽然很多，但主要集中在解毒机理方面。由于这些酶制备困难，一般很难用于制备性生物转化。微生物来源的环氧化物水解酶则制备容易，因而常被用于生物催化反应中。二、微生物环氧化物水解酶在微生物催化烯烃的环氧化过程中，可以观察到环氧化物的水解现象，这是由微生物环氧化物水解酶所引起的，微生物环氧化物水解酶在手性合成中的应用还不多。1．非末端环氧化物水解2．末端环氧化物水解细菌环氧化物水解酶能催化消旋体分支末端环氧化物(88)的对映选择性水解，其水解发生在未取代环氧碳原子上，这种催化反应可采用冻干细菌细胞作为催化剂，见图8-61。在酶法环氧化物水解反应体系中，添加其他亲核试剂会产生非乙二醇产物，反应同样具有立体选择性。例如氨解会产生α-氨基乙醇(89)，叠氮化物参加反应则产生α-叠氮醇(90)，见图8-62。第四节腈水解含有腈基的有机化合物是一种重要的合成原料。天然腈存在于植物、真菌、细菌、藻类、海绵、昆虫、甚至哺乳动物中。许多植物会产生氰基葡萄糖苷，微生物和植物还会产生脂肪族腈或芳香腈，如氰脂、蓖麻碱和苯乙腈，这些有机氰化合物不仅能作为氮的储备源，而且还能作为保护剂，阻止其他生物的侵害。生物界中有一种防御