应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

第21卷3期中国病毒学21（3）：294-2972006年5月VIROLOGICASINICAMay2006收稿日期：2005-10-19；修回日期：2006-02-24*基金项目：国家质量监督检验检疫总局重点科研项目（2002IK006-01）作者简介：刘明贵（1978-），男，江西省籍，硕士研究生，现从事基因芯片诊断系统研究。**通讯作者：王业富（1962-），男，湖北省籍，教授。现从事分子诊断与生物芯片研究。Correspondingauthor.Tel:[phone]，Email:[e-mail]应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片*刘明贵1，王业富1**，隋放2，万志香1，高文娟1（1.武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室,湖北武汉430072；2.辽阳市中心医院,辽宁辽阳111000）AVisualGeneArrayfortheDetectionofHSV-2BasedonNanogoldProbesLIUMing-gui1，WANGYe-fu1**，SUIFang2，WANZhi-xiang1，GAOWen-jun1(1.StatekeyLabofVirology,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China；2.LiaoyangCenterHospital,Liaoyang111000,China)Abstract：AvisualHSV-2detectiongenearraywasdevelopedbasedonnanogoldprobes。ThespecificprimerandprobeofHSV-2weredesignedbasedonthehighlyconservativeregionofHSV-2DNApolymerasegeneandtheHSV-2PCRampliconwerelabeledbybiotinthroughPCRreaction．Amino-modifiedprobeswerespottedonanactivatedglasssurfaceonwhichhybridizedwiththePCRamplicon．Subsequently,thestreptavidin-nanogoldwasaddedtoformtheamplificationsystemofthebiotin-streptavidin-nanogoldcomplex．Atlast,thestepofsilverstainingamplifiedthesignalofhybridization,ThereforeitwaseasytodetecttheHSV-2bynakedeyes．Aslittleas100fmol/LofHSV-2ampliconcouldbedetectedonthearray,TheHSV-2detectiongenearraycandetecttheHSV-2virusinfectionwithhighsensitivityandlowcost.Keywords：Genearray;HSV-2;Nanogold;Biotin-streptavidin;Sensitivity摘要：本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型（HerpesSimplexVirus-2,HSV-2）的基因芯片。该芯片以HSV-2DNA聚合酶的高保守区为靶序列，设计HSV-2特异性引物和探针，通过PCR反应使扩增产物标记上生物素；氨基修饰的探针固定在活化的玻片上，与生物素标记的扩增产物杂交；利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性，加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统；银染反应后，达到目视化检测HSV-2效果。该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物，具有灵敏度高，低成本的特点，通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性。关键词：基因芯片；HSV-2；纳米金；生物素-链霉亲和素；灵敏度中图分类号：Q819文献标识码：A文章编号：1003-5125(2006)03-0294-04单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)属α疱疹病毒亚科，分1型和2型，其中，HSV-2病毒主要的危害为生殖系统的感染，引发生殖系统疱疹、脓疱。HSV-2子宫内感染和新生儿感染可致死胎和发育不全[1]。另外，单纯疱疹病毒2型感染与子宫颈癌的发生有着密切联系[2]。基因芯片是90年代中期发展起来的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。其基本原理是应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析。用于标记靶核苷酸序周娟,等.裸鼠呼吸道合胞病毒感染的动物模型297297列的有酶、放射性同位素、荧光、化学发光及其他的标记物质[3]。近年来，由于纳米金标记技术本身的优点，越来越多的科学家选择纳米金来取代上述标记物。刘明贵,等.应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片295Mirkin等报道了一系列使用纳米金标记核酸探针的基因芯片方法[4~6]，为了放大检测信号，常常用银染来加强纳米金信号，以达到更高的灵敏度[7,8]。生物素—亲和素系统是七十年代后期发展起来的一种生物反应放大系统。本实验通过用生物素标记的引物对HSV-2DNA聚合酶的高保守区进行PCR扩增[7]，扩增产物与固定在基片上的探针杂交，杂交信号经过扩增产物上的生物素与纳米金标记的链酶亲和素结合，再经过银染能够显示出来，从而可以目视化检测HSV-2病毒。该检测方法具有灵敏度高、廉价的特点，有效的克服了已有检测方法存在的灵敏度低、仪器昂贵、污染环境，费时等诸多缺陷。1材料与方法1.1实验材料硅烷化偶联剂－γ-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）为教育部有机硅工程研究中心（武汉大学）产品，1，4-苯二异硫氰酸酯（PDITC）购于Sigma公司，TagDNA聚合酶，dNTPs和链酶亲和素为Promega公司产品；其它化学和生物试剂使用国产分析纯试剂。所配试剂溶液均用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC，Sigma公司）处理。配制试剂的玻璃器皿经王水浸泡后用去离子水冲洗，在180℃干燥8h以上。所有离心管、试管、吸头等用品均经高压蒸汽灭菌，一次性使用。HSV-2病毒样本取自患者生殖器溃疡部位，HSV-2DNA提取严格按广州中山医科大学达安基因诊断中心提供的检测试剂盒说明书进行。1.2引物和探针的设计与合成根据有关文献的报道[9]，本实验选择HSVDNA聚合酶基因序列高保守区为检测靶序列。从GenBank找到HSV-1与HSV-2HSVDNA聚合酶基因序列。利用CLUSTALWR多序列比对软件和BLAST软件选出最保守区序列，用引物设计软件PrimerPremier5.0设计出HSV-2上游引物P1，下游引物P2和探针（根据GenBank中编号为M16321的序列设计）。上游引物的5’端用生物素标记，探针的5’端标记带氨基的“手臂分子”（H2N-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10）来防止探针形成空间位阻[10]。引物与探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物和探针序列如下：HSV-2上游引物P1：5’-biotin-AACATCACCCGCACCATC-3′（2058-2076）HSV-2下游引物P2：5’-TGAAGCACAGGTTGTGGGC-3′（2430-2449）HSV-2探针：5’-H2N-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-GTCCCCGTCCTCGTCGT-3’(2260-2277)阳性质控点的上游引物P3：5’-biotin-GTTGGTCCGAATAACGTGCC-3′(547-566)阳性质控点的下游引物P4：5’-ACCGCCAGACGCTCCATC-3′(942-959)阳性质控点探针：5’-H2N-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-CCATCGGCACCATCGCATCT-3’（677-698）阴性质控点探针：5’-H2N-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-ACTCCCCTGTGAGGAACTACT-3’其中，阴性质控点探针是一段不与阳性质控点PCR产物和HSV-2PCR产物杂交的序列。1.3HSV-2PCR扩增5µLHSV-2DNA提取液，2µLP1（61.83µmol/L）和2µL（55.58µmol/L）P2，10µLPCRbuffer[0.075mmol/LTris,pH950mmol/LKCl，2mmol/LMgCl2,(NH4)2SO4],2µL50µmol/LdNTPs，2UTagDNApolymerase,加无菌蒸馏水至总体积100µL。经过95℃变性5min，扩增35个循环（94℃:50s,54℃:45sand72℃:50s），最后72℃延伸5min。1.4纳米金制备按照文献[11]提供的方法制备纳米金：取41.2mg氯金酸（HAuCl4·4H2O）溶入100mL双蒸水中煮沸，搅拌下迅速加入10mL38.8mmol/L柠檬酸三钠水溶液。纳米金胶体形成后，用0.45µm尼龙滤膜过滤，滤液即为需要的纳米金胶体。1.5纳米金与链霉亲和素结合物的制备为了确定稳定1mL纳米金所需的最小蛋白质用量，采用目测法来确定蛋白质用量[12]。最后确定稳定1mL纳米金最小量约为8µg。取1mL的纳米金，调节pH值至6.5，加入8µg链霉亲和素，磁力搅拌混匀，室温下静置5~10min后加入5％的小牛血清白蛋白（BSA）溶液至其终浓度为1％，放置30min，然后在4℃下以12000g高速离心45min。除去上清液，红色沉淀物用含1%BSA和0.02%NaN3的Trisbuffer(pH6.5)重悬。重离心一次，红色沉淀物用同样Trisbuffer重悬，4℃下保存。1.6HSV-2检测芯片的制备玻片根据Chrisey等的方法[13]处理活化，用作固定探针用的基片。氨基修饰的探针用0.01mol/LNaCl,0.15mol/LNaHCO3buffer稀释。取0.5µL上述稀释的探针点样。点样完毕后，将载有探针的玻片在温度为37℃，湿度为80%的恒温培养箱中固定2h,蒸馏水洗3次，1%BSA封闭25min[14]，然后40~50℃恒温箱中烘干，即得到所需基因芯片，4℃保存。1.7杂交5µLPCR产物用30µL杂交液(2×SSC,5×Denhar-296中国病毒学第21卷dt，pH7，and100μg/mLsalmonspermDNA)稀释，沸水中变性5分钟立刻置冰上2min，迅速倾倒于芯片表面，盖上盖玻片（22mm×22mm），置于湿润培养箱内54℃杂交2h后，依次2×SSC+0.1%SDS洗一次（3min），0.1×SSC+0.1%SDS洗一次（2min），0.1×SSC洗一次（3min），然后去离子水洗一次（2min）[10]。995µL0.1mol/LPBSbuffer中加入适量的金标链酶亲和素探针，37℃下杂交25min，再用去离子水洗2min，除去未杂交上的金标链酶亲和素探针。1.8银染700µL的柠檬酸缓冲液（pH3.5）与300µL的对苯二酚（0.51mol/L）充分混匀，临用前加入25-30µL硝酸银溶液（0.15mol/L）混匀。常温下避光银染12min，阳性对照出现后，立即放入水中终止银染反应。2结果2.1HSV-2PCR扩增PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶（含EB）检测，在紫外光照射下有一条大小与预期相符的PCR扩增物条带（391bp）。PCR扩增产物用上海生工生物工程技术服务有限公司提供的DNA纯化试剂盒纯化。2.2纳米金及金标探针的性质鉴定制备高质量的纳米金及金标探针是本实验的重要步骤。将4℃下保存6个月的纳米金，用透射电子显微镜（TEM）观察，用上述方法制备的纳米金大多数颗粒为圆