基因治疗

基因治疗研究DMD概述杜氏肌营养不良（DunchenneMuscularDystrophy,DMD）是一种X连锁隐性遗传病，活产男婴中的发病率约为1/3500—1/5000患儿常在3到5岁间发病，肌肉进行性萎缩，运动能力逐渐丧失，常在9—14岁间丧失行走能力，20岁左右因心肌、呼吸肌受累死于心、肺功能衰竭DMD概述DMD基因突变导致的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）功能缺失。抗肌萎缩蛋白（dystrophin）为一杆状蛋白，是肌肉细胞中的骨架蛋白，是连接肌肉细胞质中的收缩单元（肌动蛋白和肌球蛋白）与肌肉细胞膜上一系列蛋白的桥梁，分子量为427kDa，含4个结构域，即N一端结构域、中央杆状结构域、半胱氨酸富集区结构域和C端结构域。中央杆状结构域由24个血影蛋白样重复序列区和4个绞链区构成，占整个蛋白链长度的80%。DMD治疗概述DMD的治疗尚无有效手段目前临床上采用多学科综合管理的办法治疗DMD激素治疗——长期应用糖皮质激素类药物康复训练——肢体拉伸和呼吸康复训练定期的运动功能评价，根据病情进展情况选择合适的辅助运动器械手术矫形——脊柱侧凸、关节挛缩矫形手术呼吸管理——定期监测呼吸功能，必要时使用辅助通气设备心脏管理——定期监测心电图、心脏彩超，必要时使用改善心脏功能的药物如ACEI/ARB系统的多学科管理仅能一定程度的延长患者可行走时间和生存期，无法改变最终结局DMD治疗概述细胞治疗成肌细胞移植——细胞排斥反应过强肌源性干细胞治疗——来源和分化调控机制不清基因治疗——DMD根治的希望致病基因明确转基因和基因组编辑技术不断发展DMD基因治疗概述人类DMD基因位于Xp21.2-3区域，是目前已知最大的基因，全长约2.4M，包括79个外显子和78个内含子，cDNA长14kbDMD基因突变大致可分为：大片段的缺失或重复——70%微小突变（碱基的重复、缺失或插入）——30%框移突变——DMD症状严重框内突变——BMD症状较轻，不影响寿命DMD基因治疗概述DMD基因治疗思路：DMD→BMDDMD基因治疗转基因治疗DMD基因组编辑技术治疗DMD外显子跳跃终止密码通读DyscDNA裸质粒治疗DMD肌营养不良蛋白cDNA可以作为裸质粒递送优点裸质粒转导能力强免疫原性和毒性作用很弱缺点只能在注射部位局部应用仅提供瞬时肌营养不良蛋白表达难以起到期望的临床效果AAV介导的DMD转基因治疗优点转染效率高适用于体内转导在骨骼肌和心肌中均有表达缺陷容量有限，无法载导全长的dystrophincDNA免疫反应AAV介导的DMD转基因治疗mini-dystrophingene1995年，DMD基因第17到48外显子缺失、但临床症状轻微的BMD患者基因组中克隆出长为6.3kb的缩短DMD基因其编码的蛋白产物保存了正常抗肌萎缩蛋白的主要功能携带有该基因的转基因鼠骨骼肌和膈肌的肌力均教mdx小鼠有所提升,达到正常C57小鼠的75%,并且骨骼肌能够对抗运动损伤AAV介导的DMD转基因治疗mirco-dystrophingeneCrawford等发现抗肌萎缩蛋白羧基端对于维持该蛋白的功能不是必须的敲除中央杆状区的20个血影蛋白样结构和大部分羧基端（71-78号外显子）的截短的抗肌萎缩蛋白基因长度为3.75Kb,被认为是治疗DMD的有前途的候选基因之一AAV介导的DMD转基因治疗Tripletrans-splicing经裁剪的minidystrophin与microdystrophin虽仍具有抗肌萎缩蛋白部分功能，但仍遗留部分临床症状将11.1kb的全长DMD编码序列分开，分成三部分并分别包装入AAV载体同时转染靶细胞，可表达完整的抗肌萎缩蛋白这种三重AAV介导的反式剪接的方法可以应用于任何大的治疗基因（≥11kbORF）递送到有丝分裂后的组织（肌肉或神经元）中，用于治疗各种遗传性代谢和遗传疾病。AAV介导的DMD转基因治疗基因组编辑技术治疗DMDTALEN技术治疗DMD2013年，Ousterout针对性地设计靶向dystrophin基因5号外显子的TALEN，形成有功能的抗肌营养不良蛋白。结果证实纠正后的靶细胞（骨骼肌成肌细胞、皮肤成纤维细胞）抗肌萎缩蛋白表达恢复此外，该项技术介导的基因修饰对其靶细胞没有毒性效应CRISPR-Cas9技术治疗DMDCRISPR-Cas9技术治疗DMDCRISPR-Cas9技术治疗DMD2015年12月31日，Science在线发表了三篇CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于DMD基因治疗的论文。三篇论文分别由美国三家科研机构（哈佛大学、杜克大学和德克萨斯大学）独立完成，主题都是应用基因编辑技术治疗DMD。CRISPR-Cas9技术治疗DMD三篇文章有很多共同点：都是利用CRISPR/Cas9技术做删除式基因编辑；都是以DMD最广为应用动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。mdx小鼠DMD基因23号外显子存在一个无义突变，而基因编辑旨在完全删除这一外显子，形成永久性不含外显子23的DMD基因。都是以得到广泛认可的AAV为载体，运载基因编辑的部件进入体内细胞。除了观察到肌肉病理的改善——肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白外，三个团队都证实了治疗后小鼠肌肉力量的增加。都做了多种给药方式，包括肌肉局部注射和静脉注射、腹腔注射全身给药。都证实在全身治疗中，包括心肌在内的全身各肌肉均见到Dystrophin重新表达CRISPR-Cas9技术修复IPSC移植治疗使用CRISPR-Cas9技术，修复DMD患者来源的IPS细胞中抗肌萎缩蛋白基因修复后的IPS细胞分化为肌细胞，可检出抗肌萎缩蛋白HEK293T细胞筛选sgRNACRISPR/Cas9纠正iPSCs中DMD基因缺失并检测设计靶向DMD基因Exon51两端剪切位点附近的sgRNA构建Cas9-gRNA重组质粒并转染至HEK293T细胞错配酶法检测sgRNA效率取两端高效sgRNA共转染至293T细胞Cas9/sgRNA病毒感染至DMD基因Exon50缺失的iPSCs挑取细胞单克隆，筛选DMD基因Exon50-51缺失细胞株注射入mdx小鼠体内，检测Dyestrophin表达及肌力恢复情况构建Cas9-gRNA慢病毒Sanger测序验证切割效果（已完成）CRISPR/Cas9纠正iPSCs中DMD基因缺失研究PX459（Cas9骨架质粒）HEK293T转染结果（单质粒）49505152sgRNA1sgRNA2Intro50Intro51图1a错配酶法验证sgRNA结果Exon515’端2条，3’端3条，箭头所指为错配酶切割片段，显示均有错配图1b使用sgRNA521+311对293T细胞DNA进行切割，DMD基因Sanger测序结果显示51号外显子被切除。箭头所指为外显子两侧切割位点，单线为PAM序列，双线为随机插入的碱基外显子跳跃2016年９月２０日，美国FDA批准了SareptaTherapeutics公司的新药Exondys51（eteplirsen）注射液，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）患者。这是首个经FDA批准用于治疗该疾病的新药。外显子跳跃通过反义寡核苷酸改变pre-mRNA剪接，在剪接过程中去除肌营养不良蛋白mRNA中的特异性外显子，通过跳过外显子恢复阅读框，使抗肌萎缩蛋白正常表达Eteplirsen作用于51外显子，适用于约13%的DMD患者Eteplirsen临床试验中，2人使用低剂量，4人使用安慰剂，有效用药患者仅6人结果表明，dystrophin蛋白在60%—100%肌纤维中呈现，蛋白表达最多为15.6%仅显著增加了患者的6MWT是否有突出疗效尚未可知终止密码通读约10%DMD患者为无义突变氨基糖苷类药物如庆大霉素等可跳过无义突变形成的终止密码子，完成翻译，但具有耳毒性2014年12月3日，2014年8月，PTCTherapeutics公司开发的Translarna（Ataluren/PTC124）获得欧盟药监当局的有条件上市批准，用于5岁及以上无义突变型杜氏肌营养不良（nmDMD）非卧床患者的治疗。终止密码通读Translarna是一种蛋白质修复药物，用于由无义突变所致遗传性疾病的患者群体，选择性促进核糖体提前终止密码子而不是正常终止密码子的通读，旨在使含有无义突变的基因，产生功能性蛋白。优点：能够合成全长dystrophin蛋白，治疗最彻底，且无抗原性。缺点：只能针对13-15%的无义突变患者；IIb期临床疗效并不显著。终止密码通读DMD基因治疗几种常用方法的比较优点缺点基因转移无论DMD基因缺陷为何种类型，均可通过导入外源替代基因恢复或部分恢复功能。1、病毒载体存在一定风险，如自身复制、免疫激活、插入染色体致突变、致癌等，如需通过循环系统全身注射，需要相当大的病毒载量，风险更高；2、病毒载体导入基因表达不稳定，并随时间快速递减，不能持续稳定表达；3、AAV病毒载量有限，无法携带完整DystrophinmRNA，经剪裁的minidystrophin虽可替代大部分功能，但仍会遗留轻的临床症状。外显子跳跃无需特殊载体与辅助用药，直接注射生物制剂；致癌、免疫激活等副作用相对少，安全性良好。1、只能针对特定基因缺陷类型治疗，对病人选择严格；2、寡核苷酸链进入细胞膜能力有限，效率较低，特别是全身治疗，如何更好地进入目标组织等问题仍有待解决；3、寡核苷酸链仍可能有免疫原性。PTC124能够合成全长dystrophin蛋白，治疗最彻底，且无抗原性。1，不能对所有杜氏进行性肌营养不良患者进行治疗，只能针对13-15%的无义突变患者；2，IIb期临床疗效并不显著。CRISPR/Cas9操作简单，通过对基因组的修饰能达到对肌肉细胞的永久性修复。1，脱靶效应；2，效率相对低下；3，尚不能在全部细胞中表达；4，载体，Cas9蛋白及抗肌萎缩蛋白的抗原性谢谢！15037133788