化学农药微生物降解

化学农药的微生物降解倪海燕化学农药降解（生物降解）1二甲戊灵2农药微生物降解之应用3主要内容•全世界范围内由有害昆虫、杂草、植物病原微生物等所造成的农作物产量的平均损失十分严重。我国是一个农业大国，以占世界7%的耕地养活了占世界22%的人口。目前，我国耕地病虫害发生面积约2亿hm2/a。化学防治方法以其快速、高效的优点成为农业病虫害防治的主要手段。•2007年我国生产农药173.1万t(按有效成分计),首次超过美国，成为世界第一大农药生产国。大量化学农药的使用在杀灭病害、保证农业丰收的同时也带来了严重的环境问题，破坏了生态平衡，更不容忽视的是土壤中残留农药通过食物链逐级富集、传递对人、畜造成严重危害，这在发展中国家尤为严重。•农药降解技术的开发是解决化学农药对环境及食物污染问题的重要途径之一。目前，降解化学农药的方法主要有化学降解(水解、氧化分解和光化学降解等)、物理降解(超声波技术、吸附、洗涤和电离辐射等)和生物降解(微生物、降解酶和工程菌等)。•虽然传统的物理和化学方法降解农药效果不错，但成本太高，并伴有新的污染物生成，造成环境的二次污染。生物降解是指通过生物(包括各种微生物、植物和动物)的作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，并最终降解为水、二氧化碳和矿物质的过程。相对于物理和化学方法，生物降解尤其是微生物降解方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是一种安全、有效、廉价的降解农药的方法。•其中，微生物是有机化合物生物降解的第一因素,具有降解和转化有机农药的巨大潜能，被Beierink概括为“微生物的绝对可靠性”和“微生物降解的必然性”理论。土壤修复化学农药微生物降解一般思路降解性微生物分离中间代谢产物分析代谢途径重构降解基因克隆和功能分析降解化学农药的微生物微生物降解农药的机理微生物降解农药的影响因素微生物降解农药的基因资源化学农药的微生物降解ⅠⅡⅢⅣ降解化学农药的微生物•目前已经分离到多种可降解农药的微生物,包括细菌、真菌、放线菌等,主要分离自土壤或活性污泥。细菌适应能力强、易诱发突变且分布广泛,所以比较容易筛选。细菌降解菌主要有:假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterim)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单孢杆菌属(Xanthomonas)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等。•一种化学农药可以被多种微生物降解；同时，一种微生物也可对多种化学农药进行降解，这体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样性，也说明某些微生物可以应用于一种或多种农药的降解，而一些则只能用于特定种类农药的降解。•随着化学农药新品种的不断涌现，新的污染问题也将产生，新的可降解化学农药的微生物也将被人们发现和利用。•微生物对于农药的降解可分为酶促和非酶促反应。–酶促反应是指微生物以胞内酶或分泌的胞外酶直接作用于农药，通过一系列的酶促反应，如氧化、脱氢、还原、水解、合成等反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。•酶促反应是微生物降解农药的主要形式，微生物本身含降解农药的酶系基因，或本身虽无该酶系基因，但是经诱导或环境存在选择压，基因发生重组或改变产生了新的降解酶系。•主要生物化学作用有:脱卤作用、氧化还原作用、脱烷基作用、水解作用、环裂解作用等。微生物降解农药的机理•假单胞菌ADP菌株以莠去津为唯一碳源,有3种酶参与了降解莠去津的前几步反应，首先是AtzA酶催化莠去津水解脱氯的反应，得到无毒的羟基莠去津，该酶是莠去津生物降解的关键酶；其次是AtzB酶催化羟基莠去津脱氯氨基反应，产生N-异丙基氰尿酰胺；第3步是AtzC酶催化N-异丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和异丙胺；最终莠去津被降解为CO2和NH3。–非酶促形式指的是微生物通过代谢改变农药的环境离子浓度、pH等物理、化学性质，从而间接促使降解农药的过程。微生物降解农药时,并不只是进行单一的反应,多数情况下是多个反应协同作用来完成对农药的降解过程。Wang等研究了Ochrobactrumtriticipyd-1降解甲氰菊酯的途径，该菌通过水解羧酸酯键将甲氰菊酯分解为2,2,3,3-四甲基环丙烷甲酸和3-苯氧基苯甲醛，3-苯氧基苯甲醛氧化为3-PBA，3-PBA进一步代谢为4-羟基-3-苯氧基酸，4-羟基PBA被氧化原儿茶酸和p-苯二酚，原儿茶酸通过邻位裂解，p-苯二酚进一步降解为1,2,4-苯三酚。微生物降解农药有矿化作用、共代谢作用。–矿化是将有机物完全无机化的过程,是与微生物生长(包括分解代谢和合成代谢)相关的过程。被矿化的化合物作为微生物生长的基质和能源,矿化作用是最理想的降解方式,因为农药被完全降解成无毒的无机物。•石利利等研究了假单胞菌DLL-1在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能及降解机理后指出,DLL-1菌可以将甲基对硫磷完全降解为无机离子NO2-、NO3-。–共代谢作用是指微生物在有其可利用的碳源存在时，对原来不能利用的物质也可分解代谢的现象。通常情况下，共代谢只能使有机物得到修饰或转化，不能使分子完全分解。•门多萨假单胞菌DR-8菌株降解甲单脒产物为2,4-二甲基苯胺和NH3，而DR-8菌株不能以甲单脒为碳源、能源而生长，只能在添加其他有机营养基质作为碳源的条件下才能降解甲单脒，且降解产物未完全矿化，属于共代谢作用类型。微生物降解农药的影响因素•环境微生物降解农药是比较复杂的生理生化过程.土壤微生物的种类、数量、理化特性以及降解效率等与所在土壤类型、土壤物理性质、土壤形成过程、农药种类、农药的化学性质以及外部环境因子等均有密切关系.微生物个体•微生物的种类、代谢活性、适应性等都直接影响到对农药的降解与转化。不同的微生物种类或同一种类的不同菌株对同一有机底物农药或有毒物质反应也不同。农药结构•农药的基团和分子结构决定其在微生物环境中的降解行为。农药的化学结构决定了其溶解性、分子排列和空间结构、化学官能团、分子间的吸引和排斥等特征,并因此影响农药能否被微生物所摄取。农药结构一些农药易溶于水，而其他一些农药则以水溶性盐或酰胺形式使用，以提高其分散性，还有一些溶解性差的农药以乳油或悬浮剂形式使用，这不仅提高了农药的均匀分散性能，而且也有利于微生物的降解农药化学结构中所含的卤素、氮、氢等原子,会降低有机物的生物降解性,这类基团的数目越多,生物降解性越差。而羟基和羧基的存在,则有利于生物降解性。芳香族化合物,苯环上取代氯的数目越多,降解越困难,其中苯环上间位取代类型最难降解。ClickToEditTitleStyle高分子化合物比分子量小的化合物难降解,空间结构复杂的比结构简单的较难降解,与生命物质的分子结构相似度高的物质越容易被微生物降解。环境因素（土壤特性）•环境因子包括温度、酸碱度、含水量、溶氧量、盐度、有机质含量、黏度、表面活性剂等,环境因素的改变必然影响微生物对农药的降解过程。环境因子温度影响酶反应动力学和微生物生长速度。BrajeshK.Singh研究表明,土壤pH值对降解影响相对较大,不仅影响微生物降解酶的活性,同时也影响农药的化学降解。农药与土壤有机质的紧密结合降低了生物利用度，同时有些营养元素,尤其是生长因子必须从环境有机质中摄取。王军等人研究表明,土壤含水量较高条件下微生物对农药降解快,其原因可能是高含水量下土壤微生物的相对活性较高。锐普PPT论坛chinakui转载：微生物降解农药的基因资源•农药降解菌的遗传研究，目前主要集中于与农药降解有关的专一性酶的克隆与鉴定。•本课题组从多株降解性微生物中克隆到一系列的降解酶基因，包括甲基对硫磷水解酶基因mpd、磺酰脲类除草剂水解酯酶基因sulE、六六六降解基因簇lin、酰胺类除草剂水解酶基因ampA、菊酯类农药水解酶基因pytH、对硝基苯酚降解基因簇pnp、乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH、氯代乙酰胺类农药中间产物CMEPA的酰胺酶基因cmeH及多种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂如精喹禾灵、精恶唑禾草灵、氰氟草酯、禾草灵和精吡氟氯禾灵的水解酶基因chbH等。•甲基对硫磷降解菌Plesiomonassp．M6，该菌具有有机磷水解酶活性，可水解甲基对硫磷产生对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)，这与Rani等研究的甲基对硫磷降解途径一致，但M6却不能将对硝基苯酚进一步降解。通过鸟枪法从菌株M6基因组文库中筛选到该水解酶基因，并将其命名为mpd。该基因与已报道的编码甲基对硫磷水解酶的基因opd完全不同，序列比对结果也表明，mpd基因序列与opd基因无同源性。PseudomonasputidaDLL—E4可以进一步降解甲基对硫磷分解产生的PNP。•磺酰脲类除草剂是一类超高效除草剂，使用量低，但其残留造成的危害较为严重。Hang等研究了HansschlegeliazhihuaiaeS113对磺酰脲类除草剂的降解，发现这一家族的除草剂可以通过去酯化转化成无除草活性的相应的酸，并从S113中克隆到了1个与磺酰脲类除草剂去酯化代谢有关的酯酶基因sulE。•氯乙酰胺类除草剂是目前除草剂中用量排行第3的除草剂，其主力品种包括乙草胺、丁草胺等，其微生物降解也受到关注。Paracoccus属的微生物对酰胺类除草剂具有较好的降解能力。Zhang等从Paracoccussp．FLN-7中克隆到1个编码酰胺水解酶的基因ampA。AmpA可以水解酰胺类除草剂敌稗，并可以作用于多种酰胺类化合物及含酰胺键的有机磷农药。该酶的氨基酸序列与已知酰胺酶的一致性较低(小于22％)，但其活性中心的结构却与其他酰胺酶一样是保守的(Serl54-Serl78-Lys79）。•马爱芝等从长期受六六六污染的土壤中分离得到1株能以HCH为唯一碳源的高效降解菌株Sphingomonassp．BHC—A。BHC—A菌株在12h以内能够完全矿化质量浓度均为5mg·L-1的α-、β-、γ-、δ-HCH4种异构体，特别是对口一HCH的降解在国际上也属少例。•Wu等以菌株Sphingomonassp．BHC—A为材料，通过Tn5转座子插入突变法，筛选到1株完全丧失β-HCH降解功能的菌株。通过构建BHC-A45的基因组文库，筛选到1株含有Tn5转座子序列的阳性克隆，对阳性克隆的转座子侧翼进行测序，发现了1个卤代烷烃脱卤酶基因linB2。•Liang等从长期施用百菌清的土壤中分离到1株高效降解百菌清的Ochrobactrumsp．CTN．11，该菌可在无其他碳源的情况下，48h内可将50mg·L-1的百菌清完全降解。菌株CTN-11可通过水解脱氯将CTN降解为对鱼类和无脊椎动物微毒的羟基百菌清(CTN-OH)，但CTN-OH却不能被进一步降解。•为了进一步研究CTN水解脱氯的代谢过程，Wang等分离到了另1株CTN降解菌Pseudomonassp．CTN-3，该菌株具有水解脱氯酶活性。从CTN-3中克隆到1个编码CTN水解脱氯酶的基因chd，与目前报道的唯一一个水解脱氯酶(4-氯-辅酶A脱卤酶)。代谢途径显著不同。在厌氧和有氧条件下，该酶均可进行水解脱氯反应，并且不需要辅因子如辅酶A和ATP的存在。该研究为卤化芳香族化合物水解脱卤机制的研究提供了一个更好的脱氯酶。•拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂，这一家族的农药结构复杂，其微生物降解受到关注。Wang等分离到1株Sphingobiumsp．JZ-1菌株，JZ-1可以通过水解作用降解多种拟除虫菊酯农药。从JZ-1中克隆到1个羧酸酯酶基因pytH，该基因编码1个相对分子质量31×103的菊酯水解羧酸酯酶，与已发现的菊酯水解酶没有任何同源性，与α∕β折叠水解酶家族的同源性为20％左右，显示PytH是一个新的农药水解酶。农药残留微生物降解应用•农药污染的修复一般有物理、化学和生物修复等方法，但物理、化学方法处理昂贵且容易造成二次污染。•生物修复是一种低成本的环境友好型面源污染修复技术。大量的研究结果显示农药降