微生物药物产生菌的菌种保藏

微生物制药微生物药物产生菌的保藏微生物菌种的保藏方法举例菌种保藏原理：菌种保藏的原理是微生物在低温、干燥、缺氧的条件下会降低代谢活动，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而能够较长期地保藏菌种，并能推迟细胞退化，降低菌种的变异率。常用的保藏方法：包括斜面传代保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法等。这些方法操作简便易行，不需要特殊设备，为一般实验室及生产单位广泛采用。1.砂土管保藏法此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌或霉菌等。(1)无菌砂土管制备①河砂处理取河砂1000～1500g，用40目筛子过筛，除去大的颗粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有机杂质，盐酸用量应浸没砂面，约浸泡24h，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。用磁铁石除去黄砂中的铁质。②筛土取30cm以下的较贫瘠非耕作层的黄土若干，自来水冲洗至中性，烘干磨细，用100目筛子过筛。1.砂土管保藏法（续）③砂和土混合砂和土以1∶1或3∶2混合均匀，装入100mm×10mm小试管中。装量约1cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮纸。④灭菌高压蒸汽灭菌，121℃灭菌1～1.5h。每天一次，连续灭3d。在50℃以下烘干。⑤无菌检查取灭菌后的砂土少许，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养1～2d，观察有无杂菌生长。如有，则需重新灭菌。1.砂土管保藏法（续）（2）制备菌悬液首先使斜面菌体生长健壮，孢子饱满，吸取3～5mL无菌水至1支已培养待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下孢子或菌苔（注意不要带入菌丝和培养基），使成菌悬液，细胞浓度为108～1010/mL。（3）加样用无菌吸管吸取菌悬液，在每支砂土管中滴加4～5滴菌悬液，用接种环拌匀，塞上砂土管棉塞。1.砂土管保藏法（续）（4）干燥将已滴加菌悬液的砂土管置于干燥器内。干燥器内应预先放置无水氯化钙用于吸水。当无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，砂土管即可干燥。有条件时，也可用真空泵连续抽气约4h，即可达到干燥效果。1.砂土管保藏法（续）（5）抽样检查从抽干水分的砂土管中，每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许砂土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，并进行培养。检查有无杂菌生长及所保藏菌种的生长情况。1.砂土管保藏法（续）（6）保藏若经检查没有发现问题，可将砂土管继续放在干燥器内（干燥器底部盛有硅胶、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住试管口，并置于室温或4℃冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。2.斜面保藏方法（1）贴标签在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期，贴在试管斜面正上方距离试管口2～3cm处。（2）斜面接种将待保藏的菌种用斜面接种法接种在已注明菌名的试管斜面上。2.斜面保藏方法（续）（3）培养细菌置37℃恒温箱中培养18～24h，酵母菌置28～30℃恒温箱中培养26～60h，放线菌和丝状真菌置28℃培养4～7天。（4）保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏三个月至半年。3.液体石蜡保藏法（1）液体石蜡灭菌将液体石蜡置于100mL的小锥形瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于105～110℃的烘箱内约1h，以除去液体石蜡中的水分。（2）接种将菌种接种至适宜的斜面培养基上。（3）培养在适宜温度条件下培养，使其充分生长。3.液体石蜡保藏法（续）（4）加液体石蜡用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端1～2cm左右为宜，使菌种与空气隔绝。（5）保藏将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于4～5℃冰箱或室温下保存。3.液体石蜡保藏法（续）（6）转接到保藏期后，需将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后再加入适量灭菌液体石蜡，进行保藏。注意：从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅。